鉴定骨髓中是否存在保护白血病干细胞微环境的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及白血病诊断和治疗试剂盒领域，更具体地讲，涉及鉴定骨髓中是否存在保护白血病干细胞微环境的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，白血病的治疗方法和药物，主要是针对白血病(干)细胞(leukemiapropagating cells, LPCs)自身进行设计和使用，虽然能缓解疾病,但是不能清除病人体内所有的白血病细胞，因此导致复发；更准确地说，现有的治疗方法或药物，不能清除骨髓中残留的LPCs。这是由于治疗过程中，骨髓中会形成特殊的微环境(niche)对残留LPCs进行保护，使得现有的治疗方法和药物，不能清除这些细胞，导致复发。
[0003]目前已有报道白血病细胞浸润骨髓会改造或破坏骨髓微环境，但是，因为缺乏适当的方法或技术，还没有鉴定到任何白血病干细胞特定的保护niche,也没有针对该niche的治疗药物。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种鉴定骨髓中是否存在保护白血病干细胞微环境的试剂盒。
[0005]本发明所要解决的第二个技术问题是，通过阻断保护白血病干细胞微环境形成和干扰其保护LPCs，找到可干预该微环境形成和解除对LPCs保护的靶点，提供针对这些靶点的抑制剂和/或中和抗体在制备提高白血病化疗效果药物中的应用。
[0006]为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了鉴定骨髓中是否存在保护白血病干细胞微环境的试剂盒，其特征在于，所述保护白血病干细胞微环境为NSM微环境，所述NSM微环境早期为Nestin+基质干细胞，随后转变成a -SMA+基质细胞，所述Nestin+基质干细胞表达CCRl、Vimentin、LepR、0)51和0)29,所述a -SMA+基质细胞表达Vimentin,所述试剂盒包括下述抗Nestin、抗a -SMA、抗CCRl、抗Vimentin、抗LepR、抗0)51和抗0)29的抗体中的一个或多个。
[0007]为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了 CCL3抑制剂、抗CCL3中和抗体、CCL3受体CCRl抑制剂或者抗CCRl中和抗体在制备提高白血病化疗效果药物中的应用。
[0008]作为一个优选方案，所述受体抑制剂为BX471。
[0009]为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了⑶F15抑制剂或抗⑶F15中和抗体在制备提高白血病化疗效果药物中的应用。
[0010]作为一个优选方案，所述⑶F15抑制剂为干扰RNA i⑶F15。
[0011]为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了蛋白酶Furin抑制剂或抗Furin中和抗体在制备提高白血病化疗效果药物中的应用。
[0012]作为一个优选方案，所述Furin抑制剂为CMK。
[0013]本发明的优点在于，本发明首次发现保护LPCs微环境，命名为NSM-niche，并开发出鉴定白血病患者骨髓中NSM-niche是否存在的试剂盒。通过鉴定患者骨髓中是否存在NSM-niche，能准确判断疾病进展和预后。根据LPCs的保护机制，找到可干预该微环境形成和解除对LPCs保护的靶点，这些靶点的抑制剂和/或中和抗体可用于制备提高白血病化疗效果的药物，有利于清除病人体内残留的LPCs，最终治愈白血病。
【附图说明】
[0014]图1总体技术方案图。
[0015]图2白血病细胞在骨髓中的浸润和保护微环境的形成。A，实时成像观察，GFP标记的白血病细胞在骨髓中的动态浸润和破坏。B，实时成像观察用Ara-C化疗2-4天后，白血病细胞残留在骨髓中。C，HE染色显示保护微环境(niche)形成，围绕并庇护残留白血病细胞。
[0016]图3鉴定骨髓中形成保护niche的组成细胞。A_D，Ara-C化疗2天(A2D)时niche组成细胞的表型分析。E-F，Ara-C化疗4天(A4D)时niche组成细胞的表型分析。G，化疗2天时niche组成细胞的功能成球实验。H, A2D时niche组成细胞的诱导分化实验。注:早期A2D时niche组成细胞为Nestin+基质干细胞，稍晚A4D时转为a -SMA+,因此称该niche为 NSM-niche。
[0017]图4NSM_niche的形成机制。A_B，NSM-niche中残留白血病细胞高表达并分泌细胞因子。C-D，细胞因子CCL3招募Nestin+的基质干细胞。E，细胞因子CCL3扩增所招募Nestin+的基质干细胞，形成NSM-niche。F，TGF-β I诱导Nestin+基质干细胞转为a-SMA+细胞。G，NSM-niche形成模式图。
[0018]图5NSM_niche保护LPCs机制。A_B，NSM-niche所保护的白血病细胞耐药。C-D，白血病细胞分泌⑶F15。E，RT-PCR检测NSM-niche细胞表达蛋白酶Furin。F-1,免疫荧光检测，NSM-niche提供蛋白酶Furin处理⑶F15，使其成熟。J-L，成熟的⑶F15激活白血病细胞的TGF-β信息通路。Μ，成熟的⑶F15使白血病细胞耐药。N，NSM-niche保护LPCs的模式图。
[0019]图6抑制或干扰CCL3可以阻断NSM-niche的形成并明显提高化疗效果。A_C，在白血病小鼠，用CCL3/CCR1抑制剂BX471。骨髓组织HE染色(A)显示niche的形成被明显抑制，虽然不影响niche细胞由Nestin+向a-SMA+转化(B)，但能明显提高化疗(A2D，和A4D)效果，清除更多白血病细胞(C)。D-F,在白血病小鼠，用抗CCL3的中和抗体，可以同样抑制NSM-niche的形成，提高化疗效果。
[0020]图7抑制或干扰⑶F15的功能可以明显提高化疗效果。A-B，慢病毒载体介导的⑶F15干扰RNA(i⑶F15)抑制⑶F15的表达。C_E，i⑶F15的使用明显提高化疗(A2D和A4D)效果，清除NSM-niche中的白血病细胞。F，为统计图。G，用i⑶F15小鼠生存时间明显延长。H，用抗⑶F15的中和抗体，明显提高化疗效果。
[0021]图8使用Furin抑制剂CMK明显提高化疗效果。A, western blot检测骨髓液，CMK抑制pro-GDF15向mGDF15转化。B, HE染色骨髓组织。C，骨髓实时成像，显示CMK的使用，明显促进化疗(用Ara-C两天，A2D)清除白血病细胞。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023]实施例1.发现并鉴定白血病骨髓中保护LPCs微环境
[0024]试验总体技术方案如图1所示，包括以下步骤:
[0025]1.人性化白血病和化疗模型的建立。将荧光蛋白GFP标记的人白血病细胞移植给免疫缺陷小鼠(NOD-SCID IL2Gnu11，NOG),建立人性化白血病模型，之后用化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)进行治疗 2-4 天(A2D，A4D)。
[0026]2.用实时成像技术检测白血病细胞在骨髓中残留和行为。从左心室注射DiI染料显示血管结构，立即处死小鼠，取头盖骨于半固体培养基中，用共聚焦显微镜进行ex vivo成像，观察白血病细胞的残留和行为。
[0027]3.取股骨的骨髓组织，进行免疫荧光等方法原位分析各种标志分子，包括Nestin、 a-SMA、Vimentin、CCRl、LepR、CD51、CD29 等。
[0028]4.分离骨髓中分白血病细胞，用RNA-microarray和定量RT-PCR检测基因表达谱，特别分析细胞因子的表达。
[0029]5.分离骨髓中的基质细胞，用免疫荧光和流式细胞仪等方法分析了其免疫表型分子，用体外成球和分化实验检测器自我更新和分化潜能。
[0030]通过实时成像等技术我们检测到，白血病细胞浸润骨髓，在实质性破坏骨髓正常结构的情况下，给予化疗。基质细胞在骨髓中形成新的微环境(niche)。该niche提供庇护，使白血病细胞免受化疗药物的杀灭，见图2。图2为白血病细胞在骨髓中的浸润和保护微环境的形成。A，实时成像观察，GFP标记的白血病细胞在骨髓中的动态浸润和破坏。B，实时成像观察用Ara-C化疗2-