专利名称：洛伐他汀在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物洛伐他汀，具体地说涉及洛伐他汀的一种新用途。洛伐他汀(英文名称为Lovastatin)系HMG-CoA还原酶抑制剂，是治疗 高脂血症的有效药物，能降低血清中总胆固醇和LDL的水平，被广泛用于治疗 脂质代谢异常和动脉粥样硬化(Calabro等..Curr 0pin Cardiol. 2005; 20: 541-6)。洛伐他汀的化学名称为(S)-2-甲基丁酸-(lS， 3S， 7S， 8S， 8aR) -1， 2， 3， 7， 8， 8a-六氢-3， 7-二甲基-8-[2-[ (2R， 4R) -4-羟基-6氧代-2-四氢 妣喃基]-乙基]-l-萘酯 其结构式为分子式为C24H3605分子量404.55除降脂作用外，他汀类药物还有许多非调脂作用并在心血管病的防治中发 挥着关键性作用，其中包括改善内皮功能、抑制炎症因子活性、抗氧化应激反 应、减轻心脏重塑、增强移植后免疫耐受等作用(HongMK等.Am J Cardiol. 2006; 98: 866-70; Endres M.等.Atheroscler S卿1.2006; 7:31 5)。他汀类药物 是目前治疗心血管系统疾病的最有效药物(Son BK等，Circ Res 2006; 98:1024 319; Chen MS等，J Mol Cell Cardiol. 2004; 37: 889 96; Jones SP等，Circ Res 2003;93:697 9; Masahiro I等，Circ 2004; 110:413 8)。心肌缺血导致心肌细胞的死亡，形成瘢痕组织，心肌发生过度重塑，心脏 功能被极大的削弱，最终导致心力衰竭而死亡(Aceves几等，Rev Invest Clin 2005;57:156 62)。近年，随着干细胞科学的发展，大量动物实验和临床试验背景技术 均表明，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,以下简称MSCs)可以 在缺血心肌组织中存活，并通过分化形成心肌细胞、重建微循环等途径有效地 改善心功能(Hamano K等，Ann Thorac Surg. 2002;73:1210 5; Toma C等， Circulation. 2002; 105:93 8)。目前，MSCs细胞移植已成为国内外临床治疗 缺血性心脏病的安全有效方法(Miyahara Y等,Nat Med. 2006; 12: 459 65; Stamm C等，Uncet 2003;361:45 - 6; Katritsis DG等，Catheter Cardiovasc Interv. 2005; 65: 321 9; Mark FB等，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006; 290: H2196 H2203)。然而，近来研究发现，移植入心梗区的MSCs只有 部分能够存活并发挥作用，有相当数量的干细胞在缺血组织中大量凋亡，并推 测可能是心梗区的缺血缺氧病理微环境诱导的(GengYJ，等，Sci. 2003; 1010: 687 697)。因此，如何降低移植入缺血组织的MSCs凋亡率，提高其存活率，从 而达到最佳的细胞移植治疗效果，是目前干细胞移植治疗缺血性心脏病以及其 他肢体缺血性疾病的技术瓶颈。经检索，迄今为止，未发现国内外有关洛伐他汀抑制缺氧缺血环境下骨髓 间充质干细胞凋亡的研究报道。 发明内容本发明目的是针对骨髓间充质干细胞移植的存活率低，治疗效果差等缺点， 提供了能提高骨髓间充质干细胞移植的存活率，从而提高其治疗效果的药物。发明人研究发现，在体外缺血缺氧环境中，洛伐他汀可作为促细胞存活剂 抑制骨髓间充质干细胞凋亡。其机理可能是洛伐他汀阻断线粒体凋亡通路、激 活PI3K/Akt和MEK/ERK细胞存活通路。本发明基于上述发现得以完成。本发明目的之一是洛伐他汀在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物上的 应用。本发明的第二目的是洛伐他汀在制备治疗缺血性心脏病的药物上的应用。 本发明的再一 目的是洛伐他汀在制备治疗肢体缺血性疾病的药物上的应用。本发明的还一目的一种药物组合物，含有洛伐他汀。该药物组合物能抑制 骨髓间充质干细胞的凋亡。根据本发明，该药物组合物中可加入各种药用赋形 剂、添加剂及载体。上述骨髓间充质干细胞凋亡主要是由移植后的缺血缺氧环境引起的，所述
的缺血缺氧环境包括缺(低)氧缺(低)血、缺(低)氧无缺(低)血、缺(低) 血无缺(低)氧等。本发明所述的洛伐他汀可通过购买获得，使用时以无水乙醇溶解为所需浓 度即可。按照通常的方式，本发明中洛伐他汀可以制成各种剂型，包括片剂、胶囊、 滴丸和注射液等。在本发明中洛伐他汀的使用方式包括第一种为骨髓间充质干细胞移植前 以一定浓度的洛伐他汀溶液孵育1小时；第二种方式为在骨髓间充质干细胞移 植前给予受试者口服某种剂型的洛伐他汀；第三种方式为在骨髓间充质干细胞 移植前给予受试者注射洛伐他汀注射液。发明人在体外实验中用缺氧和无血清模拟体内心肌梗塞后缺血微环境，发现MSCs在上述环境中表现出Caspase信号通路依赖的细胞凋亡。本发明可用于骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病，在移植前用洛伐 他汀预处理骨髓间充质干细胞，或者在细胞移植术前给予患者洛伐他汀使其血 药浓度维持在较高水平，使移植入的骨髓间充质干细胞更好地存活，从而增强 细胞移植治疗缺血性心脏病的效果。本发明还可用于骨髓间充质干细胞移植治疗肢体缺血性疾病在移植前以洛伐他汀预处理骨髓间充质干细胞，使干细胞存活增多，从而增强治疗效果。
图1不同浓度的洛伐他汀处理后骨髓间充质干细胞的相差显微镜照片。A-F分别代表A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:洛伐他汀0. 001MM、 D:洛伐 他汀0.01MM、 E:洛伐他汀O. l,、 F:洛伐他汀1MM。图2不同浓度的洛伐他汀处理后骨髓间充质干细胞的荧光显微镜照片。 A-F分别代表A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:洛伐他汀0. 001MM、 D:洛伐 他汀0.01MM、 E:洛伐他汀O. 1MM、 F:洛伐他汀lMM。图3为洛伐他汀抗骨髓间充质干细胞凋亡的作用的Annexin V/PI流式细 胞术检测结果。A-F分别代表A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:洛伐他汀 0.001MM、 D:洛伐他汀0. OlMM、 E:洛伐他汀O. 1MM、 F:洛伐他汀1)41。图4为Annexin V/PI流式细胞术检测洛伐他汀抗骨髓间充质干细胞凋亡 的作用的柱形图。A-F分别代表A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:洛伐他汀 0.001MM、 D:洛伐他汀0. 01,、 E:洛伐他汀0. 1MM、 F:洛伐他汀l,。图5为洛伐他汀升高骨髓间充质干细胞线粒体膜电位水平的PI单染流式 细胞图。图6为洛伐他汀升高骨髓间充质干细胞线粒体膜电位水平的柱形图。 图7为Western Blot方法检测洛伐他汀减少caspase-3活化片段的生成 的免疫印迹图。图8为洛伐他汀降低caspase-3酶活性的柱形图。图9为洛伐他汀减少线粒体细胞色素C的释放的免疫印迹图。抗凋亡作用的Annexin V/PI流式细胞图。A-F分别代表A:正常对照组、B:凋 亡模型组、C:洛伐他汀1PM、 D:洛伐他汀1PM+LY294002 25MM、 E:洛伐他汀lMM +U0126 10,、 F:洛伐他汀1MM+LY294002 25PM+U0126 IOMM。图11为PI3K抑制剂LY294002和/或ERK1/2抑制剂U0126抑制洛伐他汀的 抗凋亡作用的柱形图。A-E分别代表A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:洛伐他 汀1MM、 D:洛伐他汀l幽+LY294002 25MM、 E:洛伐他汀1MM+U0126 10幽、F: 洛伐他汀1,+LY294002 25,+U0126 10,。图12为Western Blot方法检测洛伐他汀激活PI3K/Akt/GSK3 0信号通路 的免疫印迹图。图13为Western Blot方法检测洛伐他汀激活MEK/ERK1/2信号通路的免 疫印迹图。图14为LY294002和U0126增加细胞色素C的释放，并增强caspase-3活 化片段的表达和caspase-3的酶活性的免疫印迹图。图15 为LY294002和U0126增加细胞色素C的释放，并增强caspase-3活 化片段的表达和caspase-3的酶活性的柱形图。 具体实例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但下面的优选具体实施 方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1、洛伐他汀抑制骨髓间充质干细胞凋亡的体外试验 (1)、 MSCs分离及培养取用Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，以盐酸氯胺酮(80mg/kg)腹腔麻醉
后，75%酒精浸泡消毒3-5分钟。于超净台内剪取大鼠股骨和胫骨，以完全培 养基(IMDM+15%FBS)冲洗骨髓腔数次，以微吸管反复吸吹骨髓，形成分散的 单细胞悬液，接种于培养瓶中，置37 T， 5%C02细胞培养箱培养。4 5天后 细胞可生长至80%以上融合，以l: 3传代(0.25y。胰酶+ 0.04XEDTA)。取生长 良好的第一代细胞进行实验。(2) 、实验分组及处理正常对照组以完全培养基培养(IMDM+15%FBS)正常培养；凋亡模型组: 以无血清(IMDM)及缺氧处理(置于密闭缺氧罐中，内置耗氧剂)，37 。C， 5% C02孵育6小时；洛伐他汀处理组以不同浓度的洛伐他汀(0.001,、 0.01(41、 0. 1MM、 l)iiM.)预处理MSCs l小时，然后在缺氧无血清条件下继续孵育6小时。(3) 、倒置相差显微镜下观察处理结果经上述(2)处理结束后，在倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态结果 正常对照组细胞(见图1A)为长梭形，形态规则，呈漩涡状生长；凋亡模型组 及洛伐他汀0.001MM组(见图1B-C)细胞形状不规则，皱縮，呈树枝状分布； 洛伐他汀(O.Ol幽、0. l幽、1MM.)处理组细胞形态规则，长梭形，漩涡状生长 (见图1D-F)。说明洛伐他汀有抑制骨髓干细胞凋亡的作用。(4) 、荧光显微镜下观察细胞核的变化经上述(2)药物处理各组细胞后，以含1%戊二醛的PBS室温固定30分钟， PBS洗2遍后，以5ng/ml Hoechst 33342室温固定30分钟，荧光显微镜下观 察凋亡细胞核的形态，结果正常对照组(见图2A)细胞核大而均质，淡蓝染色； 凋亡模型组(见图2B)及洛伐他汀0.001飚组(见图2C)细胞核固縮、碎裂， 形态不规则，染色深；洛伐他汀(0.01MM、 0. 1MM、 l,.)处理组(见图2D-F) 细胞核似正常对照组，核大而均质，淡蓝染色。结果说明洛伐他汀有抑制骨髓 干细胞凋亡的作用。实施例2、流式细胞术检测骨髓间充质干细胞凋亡率及线粒体膜电位变化 实施例l (2)药物处理各组细胞后，按照AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒说 明，各组细胞以胰酶消化，然后冷PBS洗2遍，以Annexin V溶液室温孵育30 分钟后加入PI溶液孵育5分钟，然后上流式细胞仪检测凋亡率。Annexin-V/PI 流式检测可以区分细胞的早期凋亡与中晚期凋亡。早期凋亡时细胞膜上的PS外 翻到细胞膜外层，表现为Annexin-V阳性，但细胞膜是完整的，PI为阴性；细
胞的中晚期凋亡时细胞膜破裂，PI进入细胞，与核内的DNA结合，呈现PI阳性。 与凋亡模型组相比较，洛伐他汀(0.01MM、 0. 1MM、 1MM.)处理组(见图3D-F) 细胞早期凋亡率(Annexin V+/PI-)明显降低(P<0.01)，洛伐他汀0. 001 MM (见图3 C)组与凋亡模型组(见图3 B)比较无显著性差异。图4为细胞凋亡 率的柱状统计图，其中Annexin V+/PI-代表早期细胞凋亡，Annexin V十/PI+代表 中晚期细胞凋亡，Annexin 丫-/ 1+代表坏死细胞，结果也说明了$各4戈〗也 丁 (0. 01,、 0. 1MM、 1MM.)处理组细胞早期凋亡率明显降低。实施例3、上流式细胞仪检测线粒体膜电位水平实验按照实施例1 (2)处理的各组细胞以0. 1 pM罗丹明123在37"孵育30 分钟，上流式细胞仪检测线粒体膜电位水平。与凋亡模型组比较，洛伐他汀 (0.01MM、 0. 1MM、 1(41)处理组细胞(见图5和图6)的线粒体膜电位明显升 高，表明洛伐他汀抑制线粒体凋亡(注图5和图6中A甲m代表线粒体膜电位； 其中control代表正常对照组，Hypoxia/SD代表凋亡模型组,Hypoxia/SD+0. 01幽、 Hypoxia/SD+0. lMM和Hypoxia/SD+lMM分别代表洛伐他汀各浓度处理组)。实施例4、洛伐他汀对caspase-3的活力影响实验Caspase信号级联通路是许多细胞凋亡主要的介导途径，Caspase-3在凋亡 活化的Caspase-3参与凋亡信号传导的最后通路。按照实施例1 (2)处理的各 组细胞经洛伐他汀处理结束后，胰酶(0.25%)消化、收集细胞，提取细胞蛋白， 以考马斯亮蓝法测蛋白浓度。酶标仪测定0D舰测定caspase-3活力，结果表明 洛伐他汀(0.01PM、 0. 1MM、 1MM.)降低其活性。按50|Lig蛋白质量上样电泳， Western blot检测caspase-3活化片段，结果与酶活力检测一致(见图7和图 8)。(注图8中caspase activity代表caspase-3的活性)。实施例5、洛伐他汀对线粒体细胞色素C释放的影响按照实施例l (2)正常对照组、凋亡模型组、洛伐他汀(O.OIMM、 0. l幽、 1MM.)处理的各组细胞经胰酶(0.25%)消化、收集细胞，提取细胞蛋白，以考 马斯亮蓝法测蛋白浓度。采用Western blot法检测细胞色素C的表达，结果(见 图9)显示洛伐他汀能够抑制细胞色素C (cytochrome c)的释放。 实施例6、 LY294002和/或U0126抑制洛伐他汀的抗凋亡作用试验(1)、试验处理正常对照组以完全培养基培养(IMDM+15%FBS)正常 培养；凋亡模型组以无血清(IMDM)及缺氧处理(置于密闭缺氧罐中，内置
耗氧剂)，37。C, 5%0)2孵育6小时；洛伐他汀处理组以洛伐他汀l湖预处理MSCS 1小时，然后在缺氧无血清条件下继续孵育6小时；加抑制剂组洛伐他汀预处理细胞之前加入PI3K抑制剂LY294002和/或ERK1/2抑制剂U0126孵育1 小时。(2)、上述各组细胞处理结束后，上流式细胞仪检测PI3K抑制剂LY294002 和/或ERK1/2抑制剂U0126对洛伐他汀抗凋亡作用的影响。结果显示LY294002 和,6 ((见图lO和图ll)均能明显抑制洛伐他汀的抗凋亡效果(P〈0.05)。 实施例7、洛伐他汀激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路试验 按照实施例6(1)处理各组细胞后，胰酶(0.25%)消化、收集细胞，提取 细胞蛋白，以考马斯亮蓝法测蛋白浓度。采用Western blot法检测p-Akt、 p-GSK3P及p-ERK的表达，结果表明，洛伐他汀能够激活PI3K/Akt (见图12) 和MEK/ERK1/2 (见图13)信号通路，促进骨髓间充质干细胞的存活。实施例8、 LY294002和U0126对细胞色素C和caspase-3的影响试验 按照实施例6(1)处理各组细胞后，经胰酶(0.25%)消化、收集细胞，提 取细胞蛋白，以考马斯亮蓝法测蛋白浓度。采用Western blot法检测细胞色素 C的表达，结果LY294002和U0126均抑制洛伐他汀引起的细胞色素C释放减少 和caspase-3活化降低效应(见图14和图15)，说明洛伐他汀的抗凋亡效应是 由PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路介导，并最终作用于线粒体途径发挥作用。
权利要求
1、洛伐他汀在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物上的应用。
2、 按照权利要求l所述的应用，其特征在于洛伐他汀在制备治疗缺血性心 脏病的药物上的应用。
3、 按照权利要求l所述的应用，其特征在于洛伐他汀在制备治疗肢体缺血 性疾病的药物上的应用。
4、 一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物组合物，其特征在于含有洛 伐他汀。
全文摘要
本发明公开了洛伐他汀的一种新用途，即洛伐他汀在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物上的应用。本发明主要用于治疗缺血性心脏病和其他肢体缺血性疾病。在进行骨髓间充质干细胞移植时应用本发明，可以抑制由缺血缺氧环境引起的骨髓间充质干细胞的凋亡，促进细胞存活，从而极大提高干细胞移植的治疗效果。
文档编号A61P9/10GK101129356SQ20071011986
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月1日 优先权日2007年8月1日
发明者徐瑞霞, 曦 陈 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院