一种快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，包括如下步骤：将从骨髓腔获得的骨髓基质细胞(P0)利用含抗凝剂的无血清细胞培养液重悬；所获P0细胞悬液用含血清培养液进行培养，用复合胶原酶差速消化法，获得第一代骨髓基质干细胞(P1)；用流式细胞仪对干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记进行双重荧光区分，迅速提高骨髓干细胞比例；再次用含血清培养液培养；最后再次通过复合胶原酶差速消化的方法，获得高纯度的第二代骨髓基质干细胞(P2)。本发明的有益效果是：采用含有抗凝剂的无血清培养基α?MEM重悬从骨髓腔获取的骨髓基质细胞(P0)，防止造血细胞聚集沉降在培养皿底，干扰骨髓基质干细胞的贴壁。
【专利说明】
_种快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种获得和纯化干细胞的方法，尤其涉及一种快速获得和纯化骨髓基 质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来研究发现，成年动物哺乳的骨髓中含有一类间充质细胞一一骨髓基质干细 胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)，具有多向分化的潜能，在适当的条件下可分化为 骨骼肌细胞、血管内皮细胞、中枢神经元和神经胶质细胞等。
[0003] 骨髓组织中有多种细胞成分，除基质细胞等已经分化的细胞外，还含有两类多潜 能干细胞:造血干细胞和间充质干细胞。1987年Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养 的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下可分化为多种类型的细胞，而且经过20 - 30个培养周 期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间 质细胞，故称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)，或间质祖细胞(MPCs)， 是成人多能干细胞的一类。
[0004] BMSCs在组织工程研究中有来源广泛、取材方便、自体取材、不存在伦理问题等优 势，有望成为组织工程研究、干细胞治疗研究、功能细胞再生以及动物创伤模型研究中的理 想种子细胞。但是与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs的数量非常少，约占整个骨髓 有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少。因此，如何简便有效地从骨 髓中获取高纯度的MSCs显得尤为重要。
[0005] 在先前获取骨髓间充质干细胞的研究中，大多通常采用免疫磁珠分离法、密度梯 度离心法和差速贴壁法等来制备，但获取的BMSCs纯度及速度往往达不到要求。另外，由于 在体外培养过程中BMSCs的增殖速度与混入的成纤维细胞的分裂速度相差无几，因此在培 养数天后，成纤维细胞的生长降低了 BMSCs的纯度，虽然细胞培养过程中成纤维细胞往往在 其周围形成较多的细胞基质，与骨髓基质干细胞形成细胞基质较少相区别，但通常所用的 胰酶消化法，需要多次传代才能才逐渐降低成纤维细胞的干扰、达到令人满意的BMSCs纯 度。而实验和临床研究需要一种便捷、高效、可靠的BMSCs富集方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种便捷、高效、可靠的快速获得和 纯化骨髓基质干细胞的方法。
[0007] 这种快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0008] 1)将从骨髓腔获得的骨髓基质细胞(PO)利用含抗凝剂的无血清细胞培养液重悬；
[0009] 2)所获PO细胞悬液用含血清培养液进行培养，用复合胶原酶差速消化法，获得第 一代骨髓基质干细胞(Pl);
[0010] 3)用流式细胞仪对干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记进行双重荧光区分， 迅速提高骨髓干细胞比例；
[0011] 4)再次用含血清培养液培养；
[0012] 5)最后再次通过复合胶原酶差速消化的方法，获得高纯度的第二代骨髓基质干细 胞(P2)。
[0013] 作为优选:步骤1)中用于重悬从骨髓腔获得的骨髓基质细胞(PO)的含抗凝剂无血 清细胞培养液包括a-MEM培养液40-100ml，低分子肝素含量为100-250U/L。
[0014] 作为优选:步骤1)中所获得的骨髓细胞悬液，1000-1500r/min离心5min，弃上清后 用α-ΜΗΜ重悬，再次离心，以上步骤重复两次洗涤杂质。
[0015] 作为优选:步骤2)具体为将细胞悬液种植于含10%~15%胎牛血清α-ΜΕΜ培养液 的培养皿中，在37°C、5%⑶2、95%~98%湿度的条件下孵育，48-72h后更换培养液以去除 悬浮细胞，再将获得的贴壁细胞进行差速消化。
[0016] 作为优选:步骤2)中用于差速消化贴壁细胞、以提高所获骨髓基质干细胞纯度的 消化液为collegenase NB4复合胶原酶溶液，所用浓度为0.05-0.1 % ;添加胶原酶溶液后， 将3 · 5-10cm培养皿放入细胞培养箱内，37°C孵育5-10min后，加入0 · 05-0 · 1 %的trypsin-EDTA终止collegenase NB4消化，加含血清的α-ΜΕΜ培养液终止trypsin-EDTA消化，收集吹 打后所得细胞，以1000_1500r/min离心5min，去上清，用培养液重悬后再次离心，以洗去残 留消化液。
[0017]作为优选:步骤3)具体包括：
[0018] a.带有一种荧光的干细胞表面CD标记抗体和带有另一种荧光的非干细胞表面CD 标记抗体各IyL进行标记，IgG2a-CY5和IgGl-PE各IyL进行阴性对照标记；
[0019] b.4°C暗室中孵育30min，加无血清α-ΜΕΜ以I 000-1500r/min离心5min漂洗2遍，重 悬成ImL悬液；
[0020] c.用流式细胞仪在无菌条件下分选带有一种荧光的CD抗体标记的细胞，以及带有 另一种焚光的CD抗体标记的细胞。
[0021] 作为优选:步骤4)到步骤5)具体为:对流式细胞仪筛选后的Pl细胞，种植于含10% 胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液中，待细胞的细胞长满至培养皿底的85 %-90 %后，再次进行复合 胶原酶差速消化。
[0022] 作为优选:代际间细胞接种密度为0.25X104~0.5X104cells/cm2。
[0023] 作为优选:所述荧光为CY5、PE或FITC。
[0024] 本发明的有益效果是：1)采用含有抗凝剂的无血清培养基α-ΜΕΜ重悬从骨髓腔获 取的骨髓基质细胞(PO)，防止造血细胞聚集沉降在培养皿底，干扰骨髓基质干细胞的贴壁； 2)用干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记作为流式细胞仪筛选标记，一次筛选就大大 提高干细胞表面CD标记阳性、非干细胞表面CD标记阴性的骨髓基质干细胞比例；3)所用消 化酶为复合酶，调整消化浓度，利用其对基质干细胞和成纤维细胞的胞外基质不同消化速 度，实现差速消化分离;4)将复合胶原酶差速消化和流式细胞仪双CD抗原筛选的方法相结 合交替使用，可实现对原始骨髓基质细胞的快速纯化，并获得大量用于进一步研究所需的 骨髓基质干细胞。
【附图说明】
[0025] 图1原代干细胞经(PO)过复合胶原酶消化lOmin，得到一代干细胞(Pl)，可见Pl干 细胞形态已成圆形，而成纤维细胞或内皮祖细胞仍贴附在培养皿上(A、a图中，白箭头示干 细胞，蓝箭头示成纤维细胞或内皮祖细胞;B、b图示复合胶原酶消化IOmin前后培养皿上细 胞形态的大体观;AX 100图a X 200图B、b X 40)
[0026] 图2-代干细胞(Pl)经过流式细胞仪双⑶抗原筛选，得到75%左右的细胞，其表面 ⑶标记阳性、非干细胞表面⑶标记阴性。
[0027] 图3-代干细胞(Pl)再次经过复合胶原酶消化10s，得到二代干细胞(P2)，可见P2 干细胞形态已成圆形，数量远多于仍贴附在培养皿上的成纤维细胞或内皮祖细胞。且贴附 在培养皿上的成纤维细胞或内皮祖细胞数量明显少于获得Pl细胞时（图1)贴附在培养皿上 的数量(C、c图示复合胶原酶消化IOmin前后培养皿上细胞形态的大体观；X40)
[0028] 图4获得的二代干细胞(P2)干细胞经过流式细胞仪鉴定，细胞表面⑶标记阳性、非 干细胞表面⑶标记阴性的基质干细胞比例可达到95%左右。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合本发明实施来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限制本发 明。本发明所使用的材料，如无特别说明，均为市售产品。
[0030] 表1为干细胞表面CD抗原，可在列表任选一个干细胞表面CD抗原和一个非干细胞 表面⑶抗原组成筛选标记：
[0032] 一 .制备骨髓基质细胞悬液 [0033] 1)配置无血清培养基α-ΜΕΜ
[0034]取 10.2ga-MEM(Minimum Essential Medium Alpha)、2.2g NaHC03和 100U肝素，用 去离子水定容至1L，得到的溶液备用。
[0035] 2)重悬骨髓基质细胞的方法
[0036]用注射器抽取肝素浓度为100U/L的α-ΜΕΜ反复吹打从骨髓腔获得原始骨髓基质细 胞，得到的悬液1500r/min离心5min，弃上清后重悬，即获得骨髓基质细胞(PO)悬液，以上步 骤重复两次洗涤杂质。
[0037]二.获得高纯度的基质干细胞
[0038] 1)将洗涤后的细胞以含10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液重悬，种植于3.5cm培养皿 中，在37°C、5%C02、95%湿度的条件下孵育，48-72h后更换培养液以去除悬浮细胞，基质干 细胞已贴壁。
[0039] 2)用浓度为0.1 %的col legenase NB4复合胶原酶溶液，对贴壁细胞进行差速消 化。37°C孵育IOmin后，加入0· 1 %的trypsin-EDTA终止collegenase NB4消化，加含10%胎 牛血清的α-ΜΕΜ培养液终止trypsin-EDTA消化，收集吹打后所得细胞，以lOOOr/min离心 5min，去上清，用培养液重悬后再次离心，以洗去残留消化液，获得第一代骨髓基质干细胞 (Pl)0
[0040] 3)分别在2个Eppendof管中，加入IOOyL buffer(含2%FBS)制成含有I X IO6个细 胞的悬液。1号管分别加入CD90-CY5、CD45-PE(各lyL);2号管加入IgG2a-CY5、IgGl-PE(各1μ L)作为阴性对照。4°C暗室中孵育30min，加 buffer以I 000r/min离心5min漂洗2遍，加入 buffer IOmL制成悬液，用流式细胞仪在无菌条件下分选表达⑶90+、⑶45-干细胞标记的细 胞(约占75%，图2)。
[0041 ] 4)获得分选细胞后再次离心后弃上清，加入含10%FBS的α-ΜΕΜ培养液，吹打形成 悬液后，按细胞密度〇.5X104cells/cm2接种于IOcm培养皿中。在37°(：、5%0) 2、95%湿度的 条件下孵育。
[0042] 5)待流式细胞仪筛选后获得的细胞长满至皿底的85%，用浓度为0.05%的 collegenase NB4复合胶原酶溶液，对贴壁细胞进行差速消化。37°C孵育5min后，加入 0 · 05%的trypsin-EDTA终止collegenase NB4消化，加含10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液终止 trypsin-EDTA消化，获得的第二代骨髓基质干细胞(Ρ2)。
[0043] 6)收集吹打后所得细胞，以1000r/min离心5min，去上清，用培养液重悬后再次离 心，洗去残留消化液，细胞计数达2 X IO8，流式细胞仪进行P2细胞纯度鉴定，纯度达95 % (图 4)〇
[0044]以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可根据本发 明作出各种变化或调整，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【主权项】
1. 一种快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将从骨髓腔获得的骨髓基质细胞(P0)利用含抗凝剂的无血清细胞培养液重悬； 2) 所获P0细胞悬液用含血清培养液进行培养，用复合胶原酶差速消化法，获得第一代 骨髓基质干细胞(P1); 3) 用流式细胞仪对干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记进行双重荧光区分，迅速 提高骨髓干细胞比例； 4) 再次用含血清培养液培养； 5) 最后再次通过复合胶原酶差速消化的方法，获得高纯度的第二代骨髓基质干细胞 (P2)。2. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤1) 中用于重悬从骨髓腔获得的骨髓基质细胞(P0)的含抗凝剂无血清细胞培养液包括α-ΜΕΜ培 养液40-100ml，低分子肝素含量为100-250U/L。3. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤1) 中所获得的骨髓细胞悬液，1000_1500r/min离心5min，弃上清后用α-ΜΕΜ重悬，再次离心，以 上步骤重复两次洗涤杂质。4. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤2) 具体为将细胞悬液种植于含10 %~15 %胎牛血清α-ΜΕΜ培养液的培养皿中，在37 °C、5 % C02、95 %~98 %湿度的条件下孵育，48-72h后更换培养液以去除悬浮细胞，再将获得的贴 壁细胞进行差速消化。5. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤2) 中用于差速消化贴壁细胞、以提高所获骨髓基质干细胞纯度的消化液为collegenase NB4 复合胶原酶溶液，所用浓度为0.05-0.1 % ;添加胶原酶溶液后，将3.5-lOcm培养皿放入细胞 培养箱内，37°C孵育5-10min后，加入0.05-0.1%的trypsin-EDTA终止collegenase NB4消 化，加含血清的α-ΜΕΜ培养液终止trypsin-EDTA消化，收集吹打后所得细胞，以1000-1500r/ min离心5min，去上清，用培养液重悬后再次离心，以洗去残留消化液。6. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤3) 具体包括： a. 带有一种焚光的干细胞表面CD标记抗体和带有另一种焚光的非干细胞表面CD标记 抗体各lyL进行标记，IgG2a_CY5和IgGl-PE各lyL进行阴性对照标记； b. 4°C暗室中孵育30min，加无血清α-ΜΕΜ以1 000_1500r/min离心5min漂洗2遍，重悬成 lmL悬液； c. 用流式细胞仪在无菌条件下分选带有一种荧光的CD抗体标记的细胞，以及带有另一 种荧光的CD抗体标记的细胞。7. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:步骤4) 到步骤5)具体为:对流式细胞仪筛选后的P1细胞，种植于含10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液 中，待细胞的细胞长满至培养皿底的85%-90%后，再次进行复合胶原酶差速消化。8. 根据权利要求1所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:代际间 细胞接种密度为〇 · 25 X 104~0 · 5 X 104cells/cm2。9. 根据权利要求6所述的快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法，其特征在于:所述荧
【文档编号】C12N5/0775GK105861431SQ201610335385
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】周佳, 厉民, 王峥
【申请人】浙江省人民医院