一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞领域，具体涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法。
【背景技术】
[0002]干细胞作为再生医学和组织工程领域的研究热点之一，具有自我更新与多向分化潜能，干细胞具有自我更新与多向分化潜能，有研究证明，胚胎干细胞、骨髓干细胞、人脐带血干细胞等可被定向诱导分化为神经样细胞，成为神经细胞新的来源，因此干细胞诱导分化神经样细胞成为研究热点。
干细胞可分化为各种神经细胞包括神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，通过细胞移植来达到替代受损神经细胞、改善神经功能的作用。适宜治疗的疾病有缺氧缺血性脑损伤(如新生儿缺氧缺血性脑病、脑梗死)、退行性疾病(如帕金森氏症)、脱髓鞘病变(如多发性硬化症)、儿童外伤性脑损伤以及遗传代谢性疾病。
[0003]基于以上两个方面原因，我们需要一个高效、快速和稳定的神经细胞分化平台作为
以上研究和应用的载体。但胚胎干细胞存在培养扩增难度大，成瘤性强，并存在伦理问题等;骨髓间充质干细胞来源受限，扩增难度大，而且对供者存在一定的损伤。因此诱导后的神经样细胞应用受限，无法满足大量需求，比如用于替代治疗受损神经细胞，以及进行细胞药物的筛选。目前国内外集中于以间充质干细胞为来源诱导神经细胞分化为主，人脐带间充质干细胞是从脐带华通胶质中分离出的新型干细胞，其再生能力强，来源丰富，表面抗原性很弱，不被受体的免疫系统所识别，移植物抗宿主病极少见，并且具有向神经细胞等方向分化的功能，可作为移植治疗受损神经细胞的种子细胞。采用策略主要是多种生长因子来联合诱导，从而获得成熟的定向分化细胞。
[0004]然而怎样才能将其高效诱导分化成神经样细胞，用于细胞生物治疗其中仍存在许多问题亟需解决:I)干细胞分化为神经样细胞，受干扰因素非常多，首先是诱导方案不确定;2)采用的诱导因子不规范，不能保证干细沿预期方向分化、增殖;3)多采用β_巯基乙醇，其毒性令人望而却步，影响后续临床应用;4)诱导分化后的神经样样细胞巢蛋白分泌效率低。
【发明内容】
[0005]为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种规范的、新颖的诱导方法，可高效、 稳定地将脐带间充质干细胞诱导为神经样细胞。
[0006]本发明的目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基;本发明的另一目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基，该培养基含有以下组分:
活化素A2?6nmol/L
表皮生长因子20?30yg/L
β-神经生长因子80?120yg/L
尼克酰胺5?15mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0008]进一步的，上述培养基含有以下组分:
活化素A4nmol/L
表皮生长因子25yg/L
β-神经生长因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0009]—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，包括以下步骤:通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记。将第三代人脐带间充质干细胞用上述所述的培养基诱导培养，在UltraCULTURE培养基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生长因子，100yg/L β-神经生长因子，10 mmol/L尼克酰胺，培养至14d。以UI tra⑶LTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。
[0010]进一步的，上述诱导培养14天后即可获得神经样细胞。
[0011]本发明的有益效果是:
1)诱导培养基中所含细胞因子，均属于无毒害物质，更安全；
2)本发明诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，7天即可发现诱导细胞成神经纤维样，14天可获得成熟的神经样细胞，与现有技术诱导时间不稳定，诱导细胞不成熟，巢蛋白分泌量过低相比，大大增加了诱导效率；
3)人脐带组织易于获得;分化后神经样细胞的巢蛋白表达更高，可为神经缺失相关疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。
【附图说明】
[0012]图1流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面免疫表型，阴性表达CD14-FITC、CD34-PE、HLA-DR-APC，阳性表达CD44-FITC、CD90-PE、CD 105-APC，符合干细胞表面标志表达；
图2脐带间充质干细胞在向神经样细胞分化的过程中形态变化。(A)第三代脐带间充质干细胞呈现梭型形态(100X) ; (B)分化培养的7d后，干细胞形态开始呈现神经纤维样(100X); (C)分化培养14d后脐带间充质干细胞形态变为典型的神经样细胞(100X);
图3干细胞诱导前、诱导7d以及诱导培养14d后的细胞流式检测巢蛋白表达情况，在诱导培养的过程中，随着诱导时间延长，巢蛋白表达量逐渐增加。
【具体实施方式】
[0013]—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基，其特征在于:该培养基含有以下组分:
活化素A2?6nmol/L
表皮生长因子20?30yg/L
β-神经生长因子80?120yg/L
尼克酰胺5?15mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0014]优选的，上述培养基含有以下组分:
活化素A4nmol/L
表皮生长因子25yg/L
β-神经生长因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0015]—种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，包括以下步骤:通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记。将第三代人脐带间充质干细胞用上述所述的培养基诱导培养，在UltraCULTURE培养基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生长因子，100yg/L β-神经生长因子，10 mmol/L尼克酰胺，培养至14d。以UI tra⑶LTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。
[0016]将通过组织块方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其表面标记，确定其属于间充质干细胞。
[0017]上述诱导培养14天后即可获得成熟的神经样细胞。
[0018]上述诱导培养过程中每三天换一次液。
[0019]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020]实施例1:一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基含有以下组成:
活化素A4nmol/L
表皮生长因子25yg/L
β-神经生长因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培养基余量。
[0021]上述培养基的制备:先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、加入到UI traCU