促进CIK细胞增殖分化的人参多糖、培养基、培养方法和应用与流程

本发明涉及中药应用技术领域，具体的说是涉及提取中药材中的有效成分，并在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力的临床的应用。

背景技术：

细胞过继免疫治疗是目前的研究热点，并已进入临床试验，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞，并在此基础上修复、完善机体免疫系统的生物治疗方法。CIK细胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在体外经过多种细胞因子共同诱导，能够同时表达两种膜蛋白分子即CD3和CD56的异质细胞，它不仅具有自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤特点，还具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，具有重要的免疫治疗临床应用价值。因此，CIK细胞的体外大量增殖，即提高其体外增殖速率和对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。多糖作为一种免疫调节和促进剂对巨噬细胞、T/B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的功能都有调节作用，本发明应用人参多糖对CIK细胞的诱导和调节方面的研究有助于其更好地应用于临床。

技术实现要素：

利用人参多糖提取液有机地结合CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，建立人参多糖促进免疫细胞的大量增殖和提高杀伤力的工艺体系，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。本发明目的在于提供最优人参多糖提取液浓度在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力方面的应用。

本发明提供了一种促进CIK细胞增殖分化的人参多糖，所述人参多糖是采用水提醇沉法从人参中提取得到。

本发明提供了一种CIK细胞培养基，包括基础培养基和人参多糖。

进一步地，所述人参多糖在培养基中的含量为3～300μg/mL。优选的，所述人参多糖在培养基中的含量为30μg/mL。

进一步地，所述基础培养基选自RPM1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基。

进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。

本发明提供了一种CIK细胞培养的方法，包括以下步骤：

(1)制备CIK细胞的出发细胞；

(2)配制含有人参多糖的培养基，并添加入步骤(1)中的出发细胞，经培养获得CIK细胞。

进一步地，所述人参多糖在培养基中的含量为3～300μg/mL。优选的，所述人参多糖在培养基中的含量为30μg/mL。

进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。

进一步地，步骤(2)的方法包括37℃，5％CO₂培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液。

本发明还提供人参多糖在促CIK细胞增殖分化中的应用。

本发明还提供了利用所述制备方法制得的CIK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。

以上所述人参多糖采用经水提醇沉法从人参中提取得到。

更进一步的，本发明还提供了一种水提醇沉法提取人参多糖的方法，包括以下步骤：

(1)取人参，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取时间为2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至原体积的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使浓缩液含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液用离心机低温离心20-40分钟(离心转速为4000转/分)、收集沉淀，沉淀低温干燥得人参多糖粗品；

(2)人参多糖粗品加10倍重量水加热煮沸10-30分钟，降温，过滤，向滤液中加入95％的乙醇使含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液用离心机在4℃下离心20-40分钟(离心转速为4000转/分)，收集沉淀；

(3)重复水煮醇沉、冷藏离心过程2-3次，得到人参多糖沉淀；人参多糖沉淀加10倍重量水溶解，药液用冷冻离心机在-20℃冻实后，在4℃下融解离心20-30分钟(离心转速为4000转/分)，取上清液，上清液重复冻融离心1次后，将上清减压，减压浓缩，在4℃下干燥得到人参多糖精品。

本发明的有益效果是：(1)本发明所述的人参多糖与其他化学诱导增殖因子相比，符合细胞培养要求，即对人体无毒副作用，故诱导增殖后的CIK细胞直接可以用于临床试验。(2)与相应的多糖刺激因子相比，本发明所述的多糖提取方法精练，剂型先进，该多糖提取液功效明显，成分明确，质量可控。(3)本发明所述的人参多糖具有明显提高CIK细胞增殖速率的作用，CD3和CD56双阳性显著提高，激活后的细胞杀伤力明显高于对照CIK细胞处理。

附图说明

图1人参多糖不同浓度诱导细胞增值趋势图。

图2最优浓度人参多糖诱导后CIK细胞的表型。其中A:30μg/mL人参多糖；B:空白培养基。

图3最优浓度人参多糖诱导后CIK细胞对肿瘤的杀伤力评价。

具体实施方式

下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案，或者利用已有的临床中药注射剂而产生的其他具体的实施方案。

主要材料的准备。

一种对CIK细胞增殖分化有明显提高作用的人参多糖，所述多糖提取物的方法，包括如下步骤：

(1)取人参，加入水煎煮。合并煎液，过滤，滤液减压浓缩后；加入95％的乙醇使浓缩液含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液用离心机低温离心、收集沉淀，沉淀低温干燥得人参多糖粗品；

(2)人参多糖粗品加水煮沸，降温，过滤，向滤液中加入95％的乙醇使含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液离心后收集沉淀；

(3)重复水煮醇沉、冷藏离心过程数次，得到人参多糖沉淀；人参多糖沉淀加水溶解，药液冷冻后，在4℃下融解离心。取上清液重复冻融离心后，将上清液减压浓缩，在4℃下干燥得到人参多糖精品。

(4)精密称取经50℃真空干燥的人参多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即为人参多糖溶液。

实施例l一种人参多糖的提取方法

取人参1kg，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取时间为2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至原体积的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使浓缩液含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液用离心机低温离心20-40分钟(离心转速为4000转/分)、收集沉淀，沉淀低温干燥得人参多糖粗品；人参多糖粗品加10倍重量水加热煮沸10-30分钟，降温，过滤，向滤液中加入95％的乙醇使含醇量为80％，4℃冷藏静置过夜，将冷藏后的药液用离心机在4℃下离心20-40分钟(离心转速为4000转/分)，收集沉淀；重复水煮醇沉、冷藏离心过程2-3次，得到人参多糖沉淀；人参多糖沉淀加10倍重量水溶解，药液用冷冻离心机在-20℃冻实后，在4℃下融解离心20-30分钟(离心转速为4000转/分)，取上清液，上清液重复冻融离心1次后，将上清减压，减压浓缩，在4℃下干燥得到人参多糖精品。

精密称取经50℃真空干燥的人参多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即为人参多糖溶液。

实施例2利用细胞增殖速率筛选人参多糖的最优浓度

按常规CIK细胞培养方法，即第0天加入IFN-γ(1 000U/mL)，CD3单抗(25ng/mL)，置于CO₂培养箱37℃孵育24h后获得的CIK细胞作为出发细胞。

在出发细胞中分别加入含3种浓度梯度的人参多糖(已高温灭菌)的RPMI1640培养基，置于12孔板内培养，其中浓度梯度为300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL(即没1mL培养体系中含有的人参多糖的量分别为300μg、30μg和3μg/mL)；将加入不含人参多糖的RPMI 1640培养基作为对照，37℃，5％CO₂培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液(定期是指根据细胞生长情况来确定，例如约3d更换培养基)。每天计算细胞浓度，分析每组细胞的增殖趋势

结果见图1。从对比实验结果可以看出，与不含人参多糖的对照相比，实验组的300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL三组浓度梯度均能有效提高CIK细胞增殖速率，其中人参多糖的最优浓度为30μg/mL。

实施例3在最优浓度下的进行细胞流式检测细胞表型。

将上述方法获得的CIK出发细胞分别进行测试，A、B组代表最优浓度的人参多糖RPMI 1640培养基和不含人参多糖的RPMI 1640培养基(对照)。37℃，5％CO₂培养箱内培养，约3d更换1/2对应培养液。培养7d后将细胞液混匀取出置于15mL离心管中，1500rpm离心15min后分别加入CD₃FITC-H、CD₅₆PE-H单抗各10μl，室温避光孵育30min。流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞。30μg/mL人参多糖诱导后的细胞双阳性为0.63％(图2A)，为对照0.35％(图2B)的1.8倍。细胞经过多糖诱导培养后，具有CD3﹢单阳性的细胞明显增加；人参多糖诱导后为51.65％，为对照40.48％的1.27倍。

实施例4在最优浓度诱导下的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力测定。

在人参多糖的最优浓度下，用人参多糖培养细胞，将培养瓶中已培养7d的细胞吸出置于15mL离心管中，离心弃去上清液，用0.9％NaCl洗脱CIK细胞两次后，加0.8mL RPMI 1640培养基，计数，得出细胞浓度。弃去A549肿瘤细胞培养瓶中的上清液，加1.5mL胰酶漂洗并弃去漂洗液，再加入1mL胰酶，37℃，3min。轻拍后加5mL预热的RPMI 1640终止反应。1200rpm，5min离心收集肿瘤细胞，洗脱两次后，加10mL培养液，计数，得出细胞浓度。稀释细胞浓度，并按细胞个数比等体积加液(CIK细胞液与A549肿瘤细胞液各100μl，共200μl一孔)。阳性对照：100μl肿瘤细胞稀释液+100μlCIK细胞液，阴性对照：200μlCIK细胞液。加好液后，放于37度，CO2浓度5％培养12小时。2小时后取出孔板，将原各孔中200μl液体吸去并用200μl RPMI 1640培养基清洗5次。各孔平均加入100ul含10％CCK8的RPMI 1640培养基对细胞进行染色，放于37度，CO2浓度5％中培养4小时。取出孔板，拿到酶标仪上检测，得出人参多糖诱导的CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力结果。结果如图3所示，在靶效比E：T＝10：1时，人参多糖诱导后的CIK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤力达到97.4％，明显高于对照。