本发明属于细胞培养基
技术领域：
，具体涉及一种干细胞培养基及其制备方法。
背景技术：
：干细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。因此采用的基础培养基常常要添加血清，如马血清或胎牛血清；因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。尤其是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。中国专利申请CN105087480A公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因子，补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。中国专利申请CN104357379A公开了一种干细胞培养基，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品如(IGF-1/2)、成纤维生长因子。目前，已经研发出不含血清的干细胞培养基，但是，现有的干细胞培养基存在细胞增殖的速度慢的问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干细胞培养基及其制备方法。本发明提供的干细胞培养基能快速扩增干细胞，大大缩短了干细胞培养的时间。本发明的技术方案是：一种干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：人血白蛋白1-3mg/mL，转铁蛋白8-13μg/mL，胰高血糖素0.12-0.15μg/mL，活性炭2.5-3μg/mL，成纤维细胞生长因子13-18ng/mL，表皮生长因子7-11ng/mL，亚油酸3-6μM，槲皮素5-9μg/mL，桔梗皂苷D20-25μg/mL，昆布氨酸2-5mg/mL，腺苷脱氨酶3-7μg/mL，肉豆蔻酸1.2-1.6μM。进一步地，所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：人血白蛋白2mg/mL，转铁蛋白10μg/mL，胰高血糖素0.14μg/mL，活性炭2.8μg/mL，成纤维细胞生长因子15ng/mL，表皮生长因子9ng/mL，亚油酸5μM，槲皮素6μg/mL，桔梗皂苷D23μg/mL，昆布氨酸4mg/mL，腺苷脱氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.4μM。进一步地，所述基础培养基为DMEM或F12培养基。另外，本发明还提供了所述干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：S1向基础培养基中加入人血白蛋白、转铁蛋白、胰高血糖素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、亚油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，搅拌25-35分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌30-40分钟，加入活性炭，搅拌均匀，静置2-4小时，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6-8％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.2-7.4，灭菌温度为118℃-123℃，灭菌时间为16-20分钟，即得。优选地，所述步骤S1搅拌30分钟。优选地，所述步骤S1继续搅拌36分钟。优选地，所述步骤S1静置3小时。优选地，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为7％的碳酸钠溶液。优选地，所述步骤S2调节培养基的pH至7.3。优选地，所述步骤S2灭菌温度为121℃。优选地，所述步骤S2灭菌时间为18分钟。本发明提供的干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，加入的添加剂包括人血白蛋白、转铁蛋白、胰高血糖素和活性炭等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供干细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，转铁蛋白能够调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内；同时，它还可以与其他微量元素结合，从而调节干细胞的生长增殖与功能表达。在本发明中，人血白蛋白主要用作渗透压调节剂、生长因子的运载体、稳定剂和自由基清除剂以及营养剂等。在本发明中，胰高血糖素参与干细胞的糖代谢、脂类代谢等，能调节干细胞的增殖与功能表达。在本发明培养基中使用的活性炭，能够吸附干细胞生长中代谢的有毒物质，但是，活性炭在吸附培养基中的有害物质的同时，也能吸附生长调节物质和其它培养基中的成分，发明人在使用活性炭时，考虑到活性炭的两面性，经大量实验，得到合适的活性炭与培养基中生长调节物质的配比，使其都能更好的发挥作用。在本发明中，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子主要作为维持干细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子。在本发明中，亚油酸能够提供细胞膜合成所需的脂质。在本发明中，昆布氨酸能够促进干细胞的粘附，及其贴壁生长。在本发明中，腺苷脱氨酶能够加速细胞代谢。在本发明中，肉豆蔻酸能够促进干细胞的生长。研究发现，在干细胞培养基中加入桔梗皂苷D和槲皮素，这两种成分能与其他成分间相互作用，使干细胞的扩增速度得到进一步的提高。本发明干细胞培养基搭配合理，各成分间相互协调，共同作用，提高了干细胞扩增速度，大大缩短了干细胞培养的时间。与现有技术相比，本发明提供的干细胞培养基具有以下优势：(1)本发明提供的干细胞培养基能快速扩增干细胞，大大缩短了干细胞培养的时间。(2)本发明提供的干细胞培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染。(3)本发明提供的是一种无动物源性成分、成分确定的干细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中DMEM培养基可购自Sigma公司，F12培养基可购自Sigma公司，槲皮素可购自上海谱振生物有限公司，。实施例1、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表1所示。表1：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度添加剂终浓度人血白蛋白1mg/mL转铁蛋白8μg/mL胰高血糖素0.12μg/mL活性炭2.5μg/mL成纤维细胞生长因子13ng/mL表皮生长因子7ng/mL亚油酸3μM槲皮素5μg/mL桔梗皂苷D20μg/mL昆布氨酸2mg/mL腺苷脱氨酶3μg/mL肉豆蔻酸1.2μM所述基础培养基为DMEM培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入人血白蛋白、转铁蛋白、胰高血糖素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、亚油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，搅拌25分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌30分钟，加入活性炭，搅拌均匀，静置2小时，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.2，灭菌温度为118℃，灭菌时间为16分钟，即得。实施例2、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表2所示。表2：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度添加剂终浓度人血白蛋白3mg/mL转铁蛋白13μg/mL胰高血糖素0.15μg/mL活性炭3μg/mL成纤维细胞生长因子18ng/mL表皮生长因子11ng/mL亚油酸6μM槲皮素9μg/mL桔梗皂苷D25μg/mL昆布氨酸5mg/mL腺苷脱氨酶7μg/mL肉豆蔻酸1.6μM所述基础培养基为F12培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入人血白蛋白、转铁蛋白、胰高血糖素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、亚油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，搅拌35分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌40分钟，加入活性炭，搅拌均匀，静置4小时，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.4，灭菌温度为123℃，灭菌时间为20分钟，即得。实施例3、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表3所示。表3：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度添加剂终浓度人血白蛋白2mg/mL转铁蛋白10μg/mL胰高血糖素0.14μg/mL活性炭2.8μg/mL成纤维细胞生长因子15ng/mL表皮生长因子9ng/mL亚油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脱氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基础培养基为F12培养基。制备方法：S1向基础培养基中加入人血白蛋白、转铁蛋白、胰高血糖素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、亚油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，搅拌30分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌36分钟，加入活性炭，搅拌均匀，静置3小时，得混合物；S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为7％的碳酸钠溶液，调节培养基的pH至7.3，灭菌温度为121℃，灭菌时间为18分钟，即得。对比例1、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表4所示。表4：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度所述基础培养基为F12培养基。制备方法与实施例3类似。与实施例3的区别在于，将桔梗皂苷D替换为人参皂苷。对比例2、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表5所示。表5：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度所述基础培养基为F12培养基。制备方法与实施例3类似。与实施例3的区别在于，将槲皮素替换为黄芩素。对比例3、一种干细胞培养基所述干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，如表6所示。表6：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度添加剂终浓度人血白蛋白2mg/mL转铁蛋白10μg/mL胰高血糖素1.47μg/mL活性炭1.47μg/mL成纤维细胞生长因子15ng/mL表皮生长因子9ng/mL亚油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脱氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基础培养基为F12培养基。制备方法与实施例3类似。与实施例3的区别在于，将胰高血糖素和活性炭的终浓度均调整为1.47μg/mL。试验例一、本发明干细胞培养基对干细胞生长的影响1、试验对象：本发明实施例1-3所得干细胞培养基，以及对比例1-3所得干细胞培养基。2、试验方法：用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20mL，在1h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后800r/min离心10分钟，反复冲洗3次后加入等量15g/LⅠ型胶原酶，37℃水浴中充分振荡30分钟。800r/min离心10分钟后弃去上清。将下层细胞用PBS悬浮后加入16mmol/LNH4Cl37℃水浴中10min以裂解红细胞。800r/min离心10分钟后，再用PBS冲洗3次。最后，将细胞分别用本发明本发明实施例1-3所得干细胞培养基，以及对比例1-3所得干细胞培养基悬浮后移入培养瓶中，37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育。在培养开始，及第7天、14天、21天和28天时，分别计算细胞总数。结果如表7所示。表7：干细胞在不同培养基中扩增倍数培养基7天14天21天28天实施例1156.3±24.51371.6±48.56567.2±42.411236.1±77.3实施例2157.8±25.61370.6±42.86464.7±55.411238.5±81.3实施例3161.9±25.31374.5±41.76472.6±58.311244.2±83.3对比例151.2±14.7742.3±26.83825.6±45.16132.8±52.5对比例252.7±15.2752.1±25.73886.2±43.56242.9±50.6对比例352.5±14.5756.4±23.23873.5±44.86253.4±51.2由表7可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得干细胞培养基中细胞的扩增倍数，明显大于生长在对比例1-3所得干细胞培养基中细胞的扩增倍数。这说明，本发明干细胞培养基的扩增效果好。当前第1页1 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