一种细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法与流程

本发明属于干细胞
技术领域：
，具体涉及一种细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法。
背景技术：
：干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界将其称之为“万用细胞”。近年来，随着相关研究的不断深入，干细胞的应用范围也逐渐扩大，并日趋成熟，应用于保健及心血管、骨科等疾病的治疗。干细胞在保健及再生医学等领域的研究中具有广阔的应用前景，但依然面临着许多挑战，细胞的来源就是其中之一，而细胞来源最关键的是干细胞的分离和培养。目前，人羊膜间充质干细胞(humanamnionmesenchymalstemcells，hAMSCs)的分离培养主要集中于原代分离的得率和原代细胞的指标检测，但对于后续的体外培养方法研究的较少。忽略了后续的培养条件和方法会对细胞状态造成的不利影响。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法，用于解决羊膜间充质干细胞体外培养时细胞形态不规则、纯度低等问题。本发明对培养基的配方以及细胞接种密度的对干细胞的生长及其纯度进行了探究，最终确定了一个比较适合羊膜间充质干细胞体外培养的培养基配方和细胞接种密度，其具体技术方案如下：本发明提供了一种细胞培养基，包括：表皮生长因子、谷氨酰胺、非必须氨基酸、胎牛血清和基础培养基。优选的，每100mL基础培养基中包含：表皮生长因子0-1mL、谷氨酰胺1mL、非必须氨基酸1mL和胎牛血清8-10mL。优选的，所述谷氨酰胺的工作浓度为200mM。优选的，所述表皮生长因子的工作浓度为1μg/mL。优选的，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。本发明还提供了一种培养羊膜间充质干细胞的方法，具体为：采用上述培养基重悬羊膜间充质干细胞，然后接种于培养容器中进行传代培养。优选的，所述接种的细胞密度为6.5×104-9×104个/mL。本发明提供了一种细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法，培养基中包含表皮生长因子、谷氨酰胺、非必须氨基酸和胎牛血清，各组分配伍合理，协同增效，共同促进细胞增殖以及维持良好细胞生长形态；将本发明所提供的一种细胞培养基应用于体外培养羊膜间充质干细胞的过程中，通过调整细胞接种密度和培养基中EGF的含量，促进了细胞增殖，并在更短的时间内得到指标合格的羊膜间充质干细胞，解决了羊膜间充质干细胞体外培养时细胞形态不规则、纯度低等问题，促进细胞增殖，维持间充质干细胞的干性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为实施例2的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片；图2为实施例3的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片；图3为实施例4的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片；图4为实施例5的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片；图5为实施例6的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片；图6为实施例2的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞的部分免疫表型鉴定结果；图7为实施例3的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞的部分免疫表型鉴定结果；图8为实施例4的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞的部分免疫表型鉴定结果；图9为实施例5的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞的部分免疫表型鉴定结果；图10为实施例6的培养基培养得到的P3代羊膜间充质干细胞的部分免疫表型鉴定结果。具体实施方式下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。以下实施例中所使用的表皮生长因子(EGF)购自SIGMA，谷氨酰胺、非必须氨基酸(NEAA)、胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培养基购自GIBCO。实施例1羊膜间充质干细胞的提取分离在无菌条件下，取产后弃置的新鲜羊膜，剥离羊膜，用细胞清洗液冲洗干净，将羊膜组织剪成大小合适的组织碎片，加入3-5倍体积的0.25％胰酶，置于200r/min37℃恒温振荡器上进行消化15min；然后转移至储液瓶中，加入20mL的0.1％I型胶原酶，在37℃下进行酶解3h；再用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，离心，弃掉上清，用PBS缓冲溶液重悬沉淀，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得羊膜间充质干细胞。采用DMEM/F12培养基重悬得到的间充质干细胞，然后接种于培养皿中，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养，培养至72h后换液。实施例21、配制一种羊膜间充质干细胞培养基，其配方如下：1μg/mL表皮生长因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必须氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培养基：100mL。以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后往基础培养基中分别添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混匀，即可配制得到该细胞培养基。2、待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％Trypsin进行消化，离心，然后采用上述配制的细胞培养基进行重悬细胞，再按4×104个/mL的细胞密度接种于培养皿中进行传代培养。实施例31、配制一种羊膜间充质干细胞培养基，其配方如下：200mM谷氨酰胺：1mL；非必须氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培养基：100mL。以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后往基础培养基中分别添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混匀，即可配制得到该细胞培养基。2、待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％的Trypsin进行消化，离心，然后采用上述配制的细胞培养基进行重悬细胞，再按7.5×104个/mL的细胞密度接种于培养皿中进行传代培养。实施例41、配制一种羊膜间充质干细胞培养基，其配方如下：1μg/mL表皮生长因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必须氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培养基：100mL。以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后往基础培养基中分别添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混匀，即可配制得到该细胞培养基。2、待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％的Trypsin进行消化，离心，然后采用上述配制的细胞培养基进行重悬细胞，再按7.5×104个/mL的细胞密度接种于培养皿中进行传代培养。实施例51、配制一种羊膜间充质干细胞培养基，其配方如下：1μg/mL表皮生长因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必须氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：8mL；DMEM/F12培养基：100mL。以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后往基础培养基中分别添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混匀，即可配制得到该细胞培养基。2、待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％的Trypsin进行消化，离心，然后采用上述配制的细胞培养基进行重悬细胞，再按7.5×104个/mL的细胞密度接种于培养皿中进行传代培养。实施例61、配制一种羊膜间充质干细胞培养基，其配方如下：200mM谷氨酰胺：1mL；非必须氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培养基：100mL。以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后往基础培养基中分别添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混匀，即可配制得到该细胞培养基。2、待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％的Trypsin进行消化，离心，然后采用上述配制的细胞培养基进行重悬细胞，再按1.25×105个/mL的细胞密度接种于培养皿中进行传代培养。实施例7细胞指标的检测分别记录实施例2-6中细胞生长汇合度达90％时所需要的时间以及收集P3代羊膜间充质干细胞进行细胞指标的检测，其中，观察指标分别为：形态观察、细胞存活率和细胞免疫表型。表1为细胞汇合度达90％所需生长天数，如表1结果所示，发现所需天数为3-6天，其中实施例4-5仅需要3.5天，说明了本发明方法有效促进了羊膜间充质干细胞的生长。表1细胞生长至汇合度达90％所需生长天数分组汇合度达到90％所需时间(天)实施例26实施例35实施例43.5实施例53.5实施例63图1至图5分别为实施例2至实施例6培养得到的羊膜间充质干细胞放大100倍的光学显微照片，如图所示，本发明方法培养得到的细胞形态规则，个体大小均匀。通过对实施例2-7培养条件下的羊膜间充质干细胞进行细胞计数，计算其细胞活率，发现各实施例的细胞存活率无显著性差异，均在90％以上，说明本发明方法均能有效促进羊膜间充质干细胞的生长。在本发明的具体实施例2-7中，分别对细胞接种密度和培养基中的FBS含量进行了筛选，然后对培养得到的羊膜间充质干细胞采用流式细胞仪采用流式检测其细胞免疫表型，结果图6-10和表2所示，发现实施例4-5的流式合格率较为集中，说明本发明方法通过调整细胞接种密度和培养基中EGF的含量，可以在更短的时间内得到指标合格的羊膜间充质干细胞，细胞接种密度是影响羊膜间充质干细胞增殖的重要因素。其中，所述流式合格是指CD73+≥95％，CD90+≥95％，CD105+≥95％、HLA-DR+≤2％、CD45+≤2％、CD34+≤2％、CD11b+≤2％、CD19+≤2％。表2流式检测结果组别流式实施例2不合格(CD105表达偏低，HLA-DR表达偏高)实施例3合格实施例4合格实施例5合格实施例6不合格(CD105表达偏低，HLA-DR表达偏高)当前第1页1 2 3