本发明属于干细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种脂肪干细胞的无血清培养液及其制备方法和用途。
背景技术：
：脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是zuk等人于2001年从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪干细胞能够在体外稳定增殖，且来源丰富、取材方便、细胞获取量较大，适宜大规模培养，具有很高的临床应用价值，在细胞工程、组织工程及再生医学等领域得到广泛的应用。脂肪干细胞的贴壁较缓慢，通常需要在培养基中添加动物血清或其他促进贴壁的生长因子，以促进脂肪干细胞的贴壁和增殖。动物血清中含有能为脂肪干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白等营养物质，能促进脂肪干细胞的贴壁，但存在诸多缺点：价格昂贵，来源不稳定，批间差异较大，需要大量验证工作，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，以满足干细胞的培养要求，同时避免因使用血清带来的诸多不利因素。血清替代成分较复杂，包括生长因子、蛋白等营养成分。已有研究表明，表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等生长因子，以及三七总皂甙、丹参酮ⅡA等中药成分能有效促进干细胞的增殖。与脂肪干细胞生物学行为相关的生长因子主要有血小板衍生生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子。无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件，也是近年来的研究热点之一。中国专利申请CN103255103公开了一种无血清的脂肪干细胞培养基，该培养基在DMEM-LG培养基的基础上添加了碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、肝素、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子和丙酮酸钠等组分，但未添加促进贴壁的细胞因子，需要使用包被的培养器皿以提高贴壁性能，且未添加白蛋白等营养成分，增殖较缓慢。中国专利申请CN104877962公开了一种无血清的脂肪干细胞培养基，该培养基在IMDM培养基的基础上，还包括重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白、茶多酚和干细胞生长因子，通过纤维连结蛋白和胎球蛋白的协同作用，大大增强了脂肪干细胞的贴壁性能，无需对培养器皿进行包被，但成分较复杂。目前已有一些市售脂肪干细胞无血清培养基，如Gibco、佰通生物科技等公司的脂肪干细胞无血清培养基，但存在价格昂贵、贴壁性能不够理想等缺点，贴壁性能不佳会对脂肪干细胞的增殖、分化等一系列反应产生影响。因此，提供一种成分较简单、贴壁性能优良的无血清培养基以促进脂肪干细胞的增殖具有重要意义。技术实现要素：为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种脂肪干细胞无血清培养基，通过添加少量的二氢杨梅素和儿茶素，可显著提高脂肪干细胞的贴壁性能和增殖速率，利于脂肪干细胞的增殖和干细胞特性保持，培养基的成分较简单，成本较低。本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。本发明提供一种脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素。采用上述技术方案，DMEM低糖培养基为基础，在添加转铁蛋白、血小板衍生生长因子等营养成分的同时添加一定量的二氢杨梅素和儿茶素，可显著提高脂肪干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在的贴壁性能不够理想的问题，利于脂肪干细胞的增殖和干细胞特性保持，培养基的成分较简单，成本较低。DMEM低糖培养基提供糖类、L-谷氨酰胺和无机盐等基础物质，为脂肪干细胞的新陈代谢提供能量来源。转铁蛋白为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁，起到铁传递的作用。血清白蛋白可作为脂肪干细胞生长的营养来源，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤。血小板衍生生长因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)和转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)则主要起到脂肪干细胞生存维持和增殖刺激的作用。β-巯基乙醇具有抗氧化的作用，避免蛋白质因氧化而失活。二氢杨梅素(dihydromyricelin，DMY)为葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中主要活性成分黄酮类化合物，分子式为C15H12O8；现有研究表明，DMY具有抗氧化、清除体内自由基、消炎、止咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗高血压、降脂、抗肿瘤、保肝护肝等诸多功效，未见将DMY用于干细胞培养的报道。儿茶素(catechin)是茶汤中最主要的成分，呈苦涩味，通过从茶叶中提取得到，具有防治心血管疾病、控制肥胖、预防癌症等多种功能，可以清除自由基，常用作抗氧化剂，在染料和鞣革工业也得到较广泛的应用。优选地，所述转铁蛋白的浓度为10～50μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为0.5～5mg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述转化生长因子的浓度为10～50ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为1～20μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为10～50μg/mL，所述儿茶素的浓度为10～50μg/mL。优选地，所述转铁蛋白的浓度为20～40μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为1～3mg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述转化生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为5～15μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为15～30μg/mL，所述儿茶素的浓度为10～30μg/mL。上述浓度是发明人经大量试验筛选确定的优选浓度，对脂肪干细胞的贴壁、增殖和干细胞特性保持起到重要作用。优选地，所述转铁蛋白的浓度为25μg/mL，所述血清白蛋白的浓度为2mg/mL，所述血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，所述表皮生长因子的浓度为25ng/mL，所述转化生长因子的浓度为25ng/mL，所述β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，所述二氢杨梅素的浓度为25μg/mL，所述儿茶素的浓度为20μg/mL。优选地，所述血小板衍生生长因子为PDGF-BB，所述转化生长因子为转化生长因子-β1。优选地，所述的脂肪干细胞的无血清培养基还包括青霉素和/或链霉素。更优选地，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL。相应地，本发明还提供脂肪干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脂肪干细胞的无血清培养基。优选地，所述制备方法还包括加入青霉素和/或链霉素的步骤。此外，本发明还提供了脂肪干细胞无血清培养基在脂肪干细胞培养中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供了一种脂肪干细胞无血清培养基，通过添加少量的二氢杨梅素和儿茶素，可显著提高脂肪干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在的贴壁性能不够理想的问题，利于脂肪干细胞的增殖和干细胞特性保持，培养基的成分较简单，成本较低，实现了二氢杨梅素和儿茶素在脂肪干细胞培养方面的应用，也为脂肪干细胞的培养提供了新的选择，综合性能优于含胎牛血清的脂肪干细胞培养基。本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基的制备方法简单，可以制得质量稳定的脂肪干细胞无血清培养基。附图说明图1脂肪干细胞使用不同培养基培养的增殖曲线。图2实施例一组和实施例二组的培养基培养脂肪干细胞至第5代的细胞形态图。图3脂肪干细胞干性基因Sox-2、Oct4和Nanog的mRNA相对表达量结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步详细的描述。本发明中，所涉及的组分、试剂和试剂盒均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得，如DMEM低糖培养基购自Gibco，货号11885-076。实施例一脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为25μg/mL，儿茶素的浓度为20μg/mL。本发明中，各组分的浓度均以脂肪干细胞无血清培养基的终体积计。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脂肪干细胞的无血清培养基。实施例二脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为40μg/mL，血清白蛋白的浓度为1mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为30ng/mL，表皮生长因子的浓度为15ng/mL，转化生长因子的浓度为20ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为5μg/mL，二氢杨梅素的浓度为30μg/mL，儿茶素的浓度为10μg/mL。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脂肪干细胞的无血清培养基。实施例三脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为20μg/mL，血清白蛋白的浓度为3mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为10ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为20μg/mL，二氢杨梅素的浓度为10μg/mL，儿茶素的浓度为25μg/mL。制备方法：取DMEM低糖培养基，加入转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脂肪干细胞的无血清培养基。对比例1脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇和二氢杨梅素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为25μg/mL。制备方法同实施例一。对比例1与实施例一的区别在于：不含儿茶素。对比例2脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，儿茶素的浓度为20μg/mL。制备方法同实施例一。对比例2与实施例一的区别在于：不含二氢杨梅素。对比例3脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子和β-巯基乙醇；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL。制备方法同实施例一。对比例3与实施例一的区别在于：不含二氢杨梅素和儿茶素。对比例4脂肪干细胞无血清培养基脂肪干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、β-巯基乙醇、二氢杨梅素和儿茶素；转铁蛋白的浓度为25μg/mL，血清白蛋白的浓度为2mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为25ng/mL，表皮生长因子的浓度为25ng/mL，转化生长因子的浓度为25ng/mL，β-巯基乙醇的浓度为10μg/mL，二氢杨梅素的浓度为60μg/mL，儿茶素的浓度为20μg/mL。制备方法同实施例一。对比例4与实施例一的区别在于：二氢杨梅素的浓度由25μg/mL变为60μg/mL。实施例四脂肪干细胞的分离培养从3周龄健康SD大鼠腹股沟处无菌切取脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪干细胞，进行原代培养，待长至80～90％汇合度，以1:3进行传代，取第3代ADSCs用于本发明的贴壁检测、细胞增殖检测等实验。试验例一脂肪干细胞的贴壁检测取未经包被的24孔板，设置实施例一组、实施例二组、实施例三组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组和阳性对照组，分别加入实施例一、实施例二、实施例三、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的无血清培养基以及含10％FBS的DMEM低糖培养基，每组3个复孔，每孔接种1×105个ADSCs，放置于细胞培养箱中孵育2h，弃去培养基，使用PBS冲洗去除未贴壁细胞，然后进行消化并收集计数，结果如表1所示。表1不同无血清培养基的细胞贴壁检测结果组别细胞贴壁数实施例一组293.7±24.8实施例二组275.3±20.6实施例三组269.0±23.1对比例1组171.3±16.5对比例2组72.7±24.9对比例3组68.0±8.4对比例4组213.0±18.6阳性对照组280.7±23.5从表1可知，本发明提供的无血清培养基能显著促进脂肪干细胞的贴壁，与阳性对照组的细胞贴壁数相当，差异不具有统计学意义；对比例3组(未添加二氢杨梅素和儿茶素)的脂肪干细胞贴壁性能较差，说明无血清培养基中所含有的血小板衍生生长因子、表皮生长因子和转化生长因子等无法显著提高脂肪干细胞的贴壁性能；对比例2组(未添加二氢杨梅素)的脂肪干细胞贴壁性能较差，说明添加儿茶素的添加无法显著提高脂肪干细胞的贴壁性能；对比例1组(未添加儿茶素)的脂肪干细胞贴壁性能一般，优于对比例2组和对比例3组(P＜0.01)，但远不如本发明的实施例一至三组(P＜0.01)，说明二氢杨梅素的添加可以显著促进脂肪干细胞的贴壁，但效果远不如二氢杨梅素和儿茶素同时添加；而对比例4组(二氢杨梅素的浓度较高)虽然也能显著促进脂肪干细胞的贴壁，但效果远不如本发明的实施例一至三组(P＜0.01)。通过对比各试验组，可以发现：对比例2组和对比例3组不利于脂肪干细胞的贴壁，难以实现后续的快速增殖；一定含量二氢杨梅素和儿茶素的共同添加起到了协同促进脂肪干细胞贴壁的效果，二氢杨梅素的浓度过高反而不利于脂肪干细胞的贴壁。试验例二脂肪干细胞的细胞增殖检测将第3代脂肪干细胞以5000个/mL的密度接种到6孔板中，每孔接种2mL，设置实施例一组、实施例二组、对比例1组、对比例4组和阳性对照组，分别加入实施例一、实施例二、对比例1、对比例4的无血清培养基以及含10％FBS的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天进行换液，连续培养9天，培养过程中使用显微镜观察细胞形态，且每天分别将培养的细胞用0.25％胰酶消化，进行细胞计数，绘制细胞密度随培养时间的增殖曲线如图1所示。从图1可知，本发明实施例一和实施例二提供的无血清培养基所培养的细胞增殖速率明显优于对比例1组和对比例4组，且优于阳性对照组。实施例一组和实施例二组的培养基培养脂肪干细胞至第5代的细胞形态如图2所示，细胞呈梭形，形态均一。试验例三脂肪干细胞的细胞表型检测使用实施例一的培养基培养脂肪干细胞至第10代，弃去培养基，PBS洗涤后用0.25％胰酶消化，离心后制成悬液，加入单克隆抗体，孵育后，洗涤，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD44、CD73等的表达水平，结果如表2所示。从表2可知，使用本发明提供的无血清培养基培养脂肪干细胞至第10代的细胞表型中CD29、CD44和CD73等的阳性率均大于96％，且CD14、CD31和CD45等的阳性率均小于1％，说明脂肪干细胞的干细胞特性保持良好。表2使用本发明培养基培养的脂肪干细胞表型检测结果分子表型表达水平/％CD2998.02±0.56CD4497.15±0.39CD7397.36±0.34CD9098.49±0.42CD10596.81±0.76CD16697.50±0.63CD140.11±0.02CD310.34±0.05CD450.67±0.09HLA-DR0.88±0.08试验例四脂肪干细胞的干性基因表达检测使用实施例一的培养基培养脂肪干细胞至第10代，收集脂肪干细胞并提取RNA，反转录，采用实时荧光定量PCR仪检测脂肪干细胞干性相关基因Sox-2、Oct4和Nanog的mRNA相对表达量，结果如图3所示。从图3可知，本发明提供的培养基培养的脂肪干细胞干性基因表达良好，干细胞特性保持良好。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3