一种用于cho细胞培养的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于CHO细胞培养的无血清培养基，其成分主要包括：氨基酸，无机盐，维生素，微量元素，碳源，氮源，和缓冲液。本发明的培养基的各种营养成分含量经过大量正交实验得到优化，有利于CHO细胞的生长，提高表达量，降低重组蛋白的表达成本。
【专利说明】
一种用于CHO细胞培养的无血清培养基
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于CH0细胞培养的无血清培养基，属于动物细胞培养技术领域。【背景技术】
[0002]细胞培养技术是通过模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。培养基为细胞体外培养提供营养并促进细胞生长和增殖。细胞培养基的发展经历了鸡胚汁、天然培养基、合成培养基，以及目前常用的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基和化学成分清晰的培养基。
[0003]培养基是指可以维持动物细胞，微生物细胞，植物细胞等在体外生长的一种液体或者固体介质。目前用于动物细胞的培养基按照动物培养基的发展历程可以分为:含血清的培养基，低血清培养基，无血清培养基(含有一些植物水解物等成分补确定的培养基)， 化学成分确定的培养基(化学成分确定，但可能含有一些重组蛋白)及不含有重组蛋白的化学成分确定的培养基。通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在。在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源，价格昂贵，批间差异大，对生产和科研带来诸多不便。此外，对于利用细胞生产基因工程蛋白产品来说，血清的存在将影响重组表达产物的纯化，降低产品纯度。因此科学家经过研究开发出各种各样不含血清的培养基，以便于经过基因工程改造的细胞可以在培养基中生长同时高效地分泌重组蛋白药物，从而实现高水平地表达抗体及其他重组蛋白。
[0004]中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)是一种重要的宿主细胞，其因为转染方便，表大量高，经常被用于表达各种重组蛋白。目前市场上，各个大型培养基公司均推出了各种不同水平的 CH0 细胞培养基。几个大公司包括 Gibco, Hyclone，Invrine，Millipore，Sartor1us 等均推出了相应的CHO培养基。目前各个公司顶级的培养基产品为化学成分确定的培养基。相对于含不确定成分的无血清培养基，成分确定的培养基具有质量可控，成分明确，生产的蛋白药物批次稳定性好。化学限定培养基已经是生物制药未来的不二选择。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种可用于CH0细胞培养的无血清培养基，以便于其表达重组蛋白的纯化。
[0006]本发明公开了用于CH0细胞培养的无血清培养基，包括各种氨基酸，无机盐，维生素，微量元素，碳源，氮源，和缓冲液。
[0007]优选的，所述无血清培养基包括:甲硫氛酸0.8-1.0mM，天冬氛酸4.0-5.0mM，苏氛酸1.5-2.0mM，谷氛酸6.0-8.0mM， 结页氨酸3.0-4.0mM，半胱氨酸0.5-1.0mM，异亮氨酸2.5-3.0mM，亮氨酸2.5-3.0mM， 酪氨酸 〇.6-1.0mM，苯丙氨酸 0.5-1.0mM，赖氨酸 2.2-2.5mM，组氨酸 0.8-1.0mM， 精氨酸1.5-1.8mM，脯氨酸3.5-4.0mM，甘氨酸0.5-1.0mM，丙氨酸0.4-1.0mM，天冬酰胺 4.0-5.0mM，胰岛素 0.001-1.005mM，胆固醇 0.1-0.2mM，叶酸 0.01-0.02mM， 烟酸 0? 03-0.05mM，砒洛醇 0? 007-0.0lmM，叶黄素 0? 0005-0.00 ImM，烟酰胺 0? 007-0.0lmM，维生素 A 0? 0003-0.0009mM，泛酸钙 0? 01-0.03mM，丙酮酸钠 1.0-2.0mM， 氯化钙 0? 2-0.4mM，氯化镁 0? 4-0.6mM，氯化钠 8.0-10.0mM，氯化钾 0? 5-1.0mM，硫酸镁 0.5-1.0mM，碳酸氢钠 10.0-20.0mM，硫酸钾 1.0-2.0mM，?腐胺 0? OlmM，乙醇胺 0.1mM，棕榈酸0.0OlmM，柠檬酸亚铁10mg/L，硫酸铜 0.00005-0.0OOlmM，硒酸钠 0? 0001-0.0OlmM，氯化铝 0? 00005-0.0OOlmM，碘化钾 0? 00004-0.00006mM，葡萄糖 30.0-50.0mM，和 PBS 缓冲液 0? 5-1M, pH 7.4。
[0008]优选地，所述无血清培养基还含有Tween-80,其含量为1.0-2.0g / L。
[0009]本发明的培养基的各种成分经过大量的正交实验优化，有利于促进CH0细胞的生长并提高其表达效率，降低重组蛋白的生产成本。【具体实施方式】
[0010]本领域技术人员应该理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0011]实施例1无血清培养基的制备(1)分别称取以下量的物质:甲硫氨酸0.8mmol，天冬氨酸4.0-mmol，苏氨酸 1.5mmol，谷氨酸6.0mmol，缴氨酸3.0mmol，半胱氨酸0.5mmol，异亮氨酸2.5mmol，亮氨酸2.5mmol，酪氨酸0.6mmol，苯丙氨酸0.5mmol，赖氨酸2.2mmol，组氨酸0.8mmol，精氨酸1.5mmol，脯氨酸3.5mmol，甘氨酸0.5mmol，丙氨酸0.4mmol，天冬酰胺4.0mmol，胰岛素 0.0Olmmol，胆固醇 0.lmmol，叶酸 0.0lmmol，烟酸 0.03mmol，石比洛醇 0.007mmol，叶黄素 0.0005mmol，烟酰胺 0.007mmol，维生素 A 0.0003mmol，泛酸f丐 0.0lmmol，丙酮酸钠1.0mmol，氯化|丐0.2mmol，氯化镁0.4mmol，氯化钠8.0mmol，氯化钾 0.5_〇1，硫酸镁 0.5mmol，碳酸氢钠 10.0mmol，硫酸钾 l.0mmol，.腐胺 0.0lmmol，乙醇胺 0.lmmol，棕榈酸0.0Olmmol，梓檬酸亚铁10mg/L，硫酸铜0.00005mmol，硒酸钠0.0OOlmmol，氯化错 0? 00005mmol，鹏化钟 0? 00004mmol，和葡萄糖 30.0mmol ；(2)将上述物质混合并溶于PBS缓冲液0.5M，pH 7.4中，过滤除菌即可制备出本发明的无血清培养基。
[0012]实施例2本发明的无血清培养基与商业化培养基比较同时将表达EP0的CH0细胞株按照5x10s细胞/毫升的浓度接种本发明的无血清培养基(按实施例1所述制备)和商品化的无血清培养基FreeStyleCHO Express1n Medium(Gibco公司产品)，用相同的条件进行培养。在37°C，110转/分，二氧化碳浓度为 6.0%条件下进行培养，当葡萄糖浓度低于2克/升，补充葡萄糖到8克/升。培养48小时候收集细胞上清，测定EP0浓度，利用本发明培养基的EP0表达量为750mg/l，而商品化培养基的EP0表达量为380mg / L。由此可见，本发明的无血清培养基配方在促进充足蛋白表达方面要优于目前商品化的培养基。
[0013]本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
【主权项】
1.一种用于CHO细胞培养的无血清培养基，包括各种氨基酸，无机盐，维生素，微量元 素，碳源，氮源，和缓冲液。2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于所述无血清培养基包括:甲硫氛酸0.8-1.0mM，天冬氛酸4.0-5.0mM，苏氛酸1.5-2.0mM，谷氛酸6.0-8.0mM， 结页氨酸3.0-4.0mM，半胱氨酸0.5-1.0mM，异亮氨酸2.5-3.0mM，亮氨酸2.5-3.0mM， 酪氨酸0.6-1.0mM，苯丙氨酸0.5-1.0mM，赖氨酸2.2-2.5mM，组氨酸0.8-1.0mM，精 氨酸1.5-1.8mM，脯氨酸3.5-4.0mM，甘氨酸0.5-1.0mM，丙氨酸0.4-1.0mM，天冬酰 胺 4.0-5.0mM，胰岛素 0.001-1.005mM，胆固醇 0.1-0.2mM，叶酸 0.01-0.02mM，烟酸 0? 03-0.05mM，砒洛醇 0? 007-0.0lmM，叶黄素 0? 0005-0.0OlmM，烟酰胺 0? 007-0.0lmM，维 生素 A 0? 0003-0.0009mM，泛酸钙 0? 01-0.03mM，丙酮酸钠 1.0-2.0mM，氯化钙 0? 2-0.4mM， 氯化镁0.4-0.6mM，氯化钠8.0-10.0mM，氯化钾0.5-1.0mM，硫酸镁0.5-1.0mM，碳酸 氢钠 10.0-20.0mM，硫酸钾 1.0-2.0mM，腐胺 0.0lmM，乙醇胺 0.1mM，棕榈酸 0.0OlmM， 柠檬酸亚铁l〇mg/L，硫酸铜0.00005-0.000ImM，硒酸钠0.0001-0.00ImM，氯化铝 0? 00005-0.0OOlmM，碘化钾 0? 00004-0.00006mM，葡萄糖 30.0-50.0mM，和 PBS 0? 5-1M, pH 7.4。3.如权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于所述无血清培养基还含有 Tween-80,其含量为 1.0-2.0g / L〇
【文档编号】C12N5/071GK105985926SQ201510098842
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月6日
【发明人】王玉
【申请人】王玉