一种免疫细胞的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于培养免疫细胞的无血清培养基，该培养基包括基础培养基、牛血清白蛋白、脂肪酸、胆固醇、胰岛素、转铁蛋白、2-巯基乙醇、丙谷二肽、甘油酯。本发明的无血清培养基成分简单、性状稳定、诱导CIK的效率更高，培养获得的CIK细胞，具有批间差异小、质量稳定、便于质控、减少患者意外感染的优点，对于免疫治疗的推广应用具有重要意义。
【专利说明】-种免疫细胞的无血清培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物、医学领域，具体地说，本发明是涉及一种免疫细胞的无血清培养 基。
【背景技术】
[0002] 肿瘤过继免疫治疗（adoptive immunotherapy, ACI)是指通过向肿瘤患者输注具 有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的 目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子（IL2、 干扰素)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK细胞、肿瘤浸润 性淋巴细胞（TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced kill cells, CIK)等；特 异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞 (DC)，细胞毒T淋巴细胞（⑶8+细胞）等。ACI在恶性实体肿瘤治疗中的应用已引起了人们 的普遍关注。ACI可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立 长期的特异性抗肿瘤免疫效应，克服了疫苗免疫治疗的诸多缺陷，具有良好的应用前景，成 为近年来肿瘤免疫治疗中十分活跃的研究领域。
[0003] 目前体外培养免疫细胞主要还是用含有人AB血清或FBS的培养基。使用动物血 清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的 风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持免疫细胞的 生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持免疫细胞的生长，但是人AB血清来源困 难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。
【发明内容】
[0004] 本发明首先提供一种用于培养免疫细胞的无血清培养基，该培养基包括基础培养 基、牛血清白蛋白、脂肪酸、胆固醇、胰岛素、转铁蛋白、2-巯基乙醇、丙谷二肽、甘油酯；
[0005] 其中基础培养基是 Iscove's Modif ied Dulbecco's Media( IMDM，gibco)、或者是 RPMI-1640 (gibco)，或者是 Dulbecco's Modified Eagle Medium (gibco)和 Ham，s_F12 (gibco)按照1:1的体积比例混合而成的，优选的为Iscove's Modified Dulbecco's Media ；
[0006] 其中牛血清白蛋白的含量为5-10mg/ml，优选的含量为lOmg/ml ;
[0007] 其中脂肪酸的含量为0. 1-10μ g/ml，优选含量为10μ g/ml ;
[0008] 其中胆固醇的含量为10-20 μ g/ml，优选含量为20 μ g/ml ;
[0009] 其中胰岛素的含量为10-20 μ g/ml，优选含量为20 μ g/ml ;
[0010] 其中转铁蛋白的含量为〇. 5-15 μ g/ml，优选含量为15 μ g/ml ;
[0011] 其中2-巯基乙醇的含量为I. 0-5.0 μ g/ml，优选含量为5.0 μ g/ml ;
[0012] 其中丙谷二肽的含量为0. 5-3mM，优选含量为2mM ;
[0013] 其中甘油酯的含量为〇· 5-20 μ g/ml，优选含量为20 μ g/ml ;
[0014] 其中pH值保持在6. 8-7. 2之间，最佳pH值保持在7. 0。
[0015] 将上述各组分混合，加水溶解，即可得到本发明的无血清培养基。
[0016] 用本发明的无血清培养基培养获得的CIK细胞与现在常用的含血清培养基培养 获得的CIK细胞相比，具有批间差异小、质量稳定、便于质控、减少患者意外感染的优点，对 于免疫治疗的推广应用具有重要意义。与市场上其他的无血清培养基相比，成分更简单、性 状更稳定、诱导效果CIK效率更高。本发明有助于提高国内细胞治疗的安全性和标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图IAIM-V培养CIK的流式细胞术检测结果图；
[0018] 图2实施例1的无血清培养基培养CIK的流式细胞术检测结果图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
[0020] 实施例I :1000ml无血清培养基的制备
[0021] 将一袋一升装IMDM干粉（Gibco)UOg牛血清白蛋白（Roche)、IOmg脂肪酸 (sigma)、20mg 胆固醇（sigma)、20mg 胰岛素（sigma)、15mg 转铁蛋白（sigma)、5mg2_ 巯基乙 醇（Amresco)、434mg 丙谷二肤（sigma)、20mg 甘油酯（sigma)、3. 024g NaHCO3 (sigma);超 纯水加至1000ml，搅拌溶解，调节PH值至7. 0左右，0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0022] 实施例2 :造血干细胞的分离
[0023] 无菌条件下取足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50? 80ml，放于含CPDAl复合抗凝剂的采血袋中，4°C保存，所有样本均在12小时内进行分离； 将一份脐血分成三份。每份用生理盐水1:1进行稀释，将稀释好的脐带血沿管壁缓慢加入 含Ficoll Hypaque人淋巴细胞分离液上层(两者比例为1:1)，其相对密度为1.077g/L，进 行梯度离心（2000r/minX30)，取中间云雾状的单个核细胞层，用MDM培养液离心洗涤2 次，每次l〇〇〇r/min，离心5min。弃上清后用无血清培养基重新悬浮细胞调整密度成3? 5X10 6/ml。
[0024] CIK细胞的诱导和扩增
[0025] 在上述分离的干细胞悬液中添加重组人IFN-Y终浓度为1000u/ml，然后移入培 养瓶中，置于37°C，5%C0 2饱和湿度培养箱中培养24小时，之后，每瓶添加人⑶3单克隆抗 体,人重组白介素1和人重组白介素2,终浓度分别为100ng/ml，100u/ml和500u/ml。继续 培养48?72小时后显微镜下细胞计数，然后用CIK细胞培养液调节细胞密度为3 X IO5Ail， 分装到T25培养瓶中，进行扩大培养，此后，每隔72小时按上述相同条件扩大培养一次，培 养至第21天时收集CIK细胞待用。
[0026] 实施例3 :CIK细胞诱导及测试
[0027] 无菌条件下取足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50? 80ml，放于含CPDAl复合抗凝剂的采血袋中，4°C保存，所有样本均在12小时内进行分离；将 一份脐血分成三份。每份用生理盐水1:1进行稀释，将稀释好的脐带血沿管壁缓慢加入含 Ficoll Hypaque人淋巴细胞分离液上层（两者比例为1:1)，其相对密度为1.077g/L，进行 梯度离心（2000r/minX 30)，取中间云雾状的单个核细胞层，用頂DM培养液离心洗涤2次， 每次1000r/min，离心5min。弃上清后，用MDM培养液调整细胞为lXIOVml，往预先加了 900 μ I AM-V (gibco) (AM-V作为对照)、900 μ 1实施例1的无血清培养基的6孔板中 各加入100 μ 1，即接种密度为IX IOfVml (2个重复)，每孔lml。再往6孔板中添加重组人 IFN- γ终浓度为1000u/ml，然后移入培养瓶中，置于37°C，5%C02饱和湿度培养箱中培养24 小时，之后，每孔添加人CD3单克隆抗体，人重组白介素1和人重组白介素2,终浓度分别为 100ng/ml，100u/ml和500u/ml。此后，每隔72小时进行一次换液，培养至第21天时收集 CIK细胞待用。
[0028] 本次实验结果表明，在培养21天后，AM-V组的细胞扩增了 5倍左右，而本发明的 培养基扩增了 15倍左右(见表1)。同时这2组细胞存活率都在98%左右。而流式细胞术检 测⑶3+⑶56+双阳性细胞，AM-V组为8. 4% (图1)，本发明培养基为23. 2% (图2)。从本次 实验中看出，不管是从CIK的扩增状况，还是CD3+CD56+双阳性细胞本发明培养基都明显优 于 AM-V。
[0029] 表1两种培养基培养21天的CIK细胞生长情况
[0030]
【权利要求】
1. 一种用于培养免疫细胞的无血清培养基，其特征在于该培养基包括基础培养基、牛 血清白蛋白、脂肪酸、胆固醇、胰岛素、转铁蛋白、2-巯基乙醇、丙谷二肽和甘油酯； 其中基础培养基是Iscove's Modified Dulbecco's Media、或者是RPMI-1640,或者是 Dulbecco's Modified Eagle Medium和 Ham' s_F12 按照 1:1 的体积比例混合而成的。
2. 根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的无血清培养基，其特征在于 其中牛血清白蛋白的含量为5-10mg/ml ; 其中脂肪酸的含量为〇. 1-lOu g/mll ; 其中胆固醇的含量为10-20 ii g/ml ; 其中胰岛素的含量为10-20 U g/ml ; 其中转铁蛋白的含量为0.5-15 yg/ml ; 其中2-巯基乙醇的含量为1. 0-5. 0 y g/ml ; 其中丙谷二肽的含量为〇. 5-3mM ; 其中甘油酯的含量为〇. 5-20 y g/ml。
【文档编号】C12N5/0783GK104371973SQ201310357469
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】胡少青, 刘洋, 赵静, 邱晔, 张丽丽, 吴明远, 王翔, 孙迎秋, 施洁琦, 范星洲 申请人:协和华东干细胞基因工程有限公司