用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基及其应用
【专利摘要】一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于所述的无血清培养基包含5?10g/L碳水化合物、1?5g/L氨基酸、5?10g/L无机盐、0.01~0.05g/L维生素、5~10g/L酵母提取物以及10?20ml/L的脂质乳化剂。与传统的添加血清成分的培养基相比较具有成本低、易于配制，无动物源性污染、批次稳定等特点，与一般的商业化培养基相比较，能悬浮培养细胞，提高表达量，更适合于大规模生产应用，有利于重组蛋白的稳定获得。
【专利说明】
用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及培养基领域，涉及到一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基及其 应用。
【背景技术】
[0002] 细胞培养是指将细胞在体外进行繁殖和培养。起于20世纪初的细胞培养技术已成 为医学和生物学研究领域中的重要工具，越来越多的生物药物如单抗、疫苗和活性蛋白质 等都是利用细胞成功表达和生产的。在最近20年里，以昆虫细胞为代表的无脊椎动物细胞 培养在应用生物医学领域中发挥的作用愈发重要。以杆状病毒为载体，昆虫细胞表达系统 已被广泛应用于生产外源蛋白，备受人们的青睐。另外，昆虫细胞表达系统还被认为是表达 病毒样颗粒疫苗的最佳系统，已成功开发了多种人用和动物用疫苗。
[0003] 大规模的体外细胞培养需要提供适合细胞生长的有利环境，包括营养成分、温度、 pH、渗透压、氧气和培养瓶或特定的培养界面等。良好的培养基可提供细胞生长所需的营养 成分、合适的PH和渗透压，是细胞培养中最为关键的因素。
[0004]传统的商业化细胞培养基需要添加大量的血清或血清白蛋白用于辅助细胞生长。 高价格且不易获取的血清常成为重要的限制因素。从生产的角度来看，在培养基中大量使 用动物血清或血清白蛋白也是有问题的，由于血清中存在未被鉴定的蛋白质，使得下游的 产品纯化更加复杂化。另外，血清中污染的动物病毒可能造成严重的安全问题。血清的批间 质量存在差异，科学家或生产工程师需要根据这种差异性进行调整，从而增加工作量。 [0005]目前已经开发出一些用于培养昆虫细胞的无血清培养基，但这些培养基普遍存在 成本过高或不能适用于悬浮培养。如2010年5月13日提交的CN101988047A不适用于悬浮培 养，且培养的细胞密度低。再比如，JP20060185008所述的培养基含有多找小分子添加物和 重组蛋白，具有很高的成本。公开号为CN1498267A所述培养基含有大量进口的水解乳白蛋 白和酵母提取物，显著的提高了成本。目前已开发的培养基的另外一个缺点是不能直接用 于柱上纯化，需要经过浓缩等其它处理步骤后才可用于纯化，不利于表达产物的后续处理。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，以克服现有 培养基制备复杂、配制复杂，生产成本高的问题。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于:所述的无血清培养基包含 5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L无机盐、0.01~0.05g/L维生素、5~10g/L酵母提 取物以及10_20ml/L的脂质乳化剂。
[0008] 进一步，所用的氨基酸可包括150-250mg/L天冬氨酸、20-50mg/L苏氨酸、40-80mg/ L丝氨酸、200_300mg谷氨酸、40_80mg/L甘氨酸、50-100mg/L缴氨酸、100_200mg/L蛋氨酸、 100_200mg/L 异亮氨酸、30_50mg/L 亮氨酸、100_200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 赖氨酸、20- 5011^/1^组氨酸、100-15011^/1^精氨酸、50-10011^/1^脯氨酸、180-30011^/1^天冬酰胺、1000-1200mg/L谷氨酰胺、10-30mg/L半胱氨酸及30-80mg/L酪氨酸。
[0009] 进一步，所用维生素包括0.1-0.31^/1生物素、5-101^/1泛酸、10-15 11^/1烟酸、 0 · 1-0 · 5mg/L 对氨基苯甲酸、0 · 5-0 · 8mg/L维生素 BI、l-3mg/L维生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L维生素 BI2、I_3mg/L核黄素、0 · I-0 · 4mg/L叶酸、15_20mg/L氯化胆碱。
[0010] 进一步，所用无机盐可包括200-800mg/L氯化钙、800-1200mg/L硫酸镁、500-80011^/1氯化钾、400-100011^/1碳酸氢钠、1500-300011^/1氯化钠、800-120011^/1磷酸二氢 钠；含于1000X浓缩液的〇. 005-0.0 lSmg/!六水合氯化钴、0.01-0.05mg/L二水合氯化铜、 0 · 001-0 · 01mg/L四水合氯化锰、0 · 05-0 · 20mg/L氯化锌、0 · 1-0 · 2mg/L七水合硫酸亚铁、 0 · 001-0 · 01mg/L七水合钼酸铵。
[0011] 本发明的目的还在于提供一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基在悬浮培 养昆虫细胞中的应用。
[0012] 用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基的主要成分为碳水化合物、氨基酸、无机 盐、维生素、酵母提取物和脂质乳化剂。
[0013] 碳水化合物如葡萄糖、果糖和麦芽糖是大部分昆虫细胞的主要碳源和能源。在多 数培养基中，葡萄糖作为碳源能被迅速利用，虽然在杆状病毒感染后昆虫细胞的生长也会 消耗部分蔗糖，但它在培养基中所起主要作用是调节渗透压。本发明的培养基中所含碳水 化合物含量在5-8g/L，且不含蔗糖和麦芽糖，有利于发酵过程中对渗透压的控制。
[0014] 不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求，其中有14种是必需氨基酸，细胞本 身不能合成，必须由培养基提供。
[0015] 可用于本发明的氨基酸包括，150-250mg/L天冬氨酸、20-50mg/L苏氨酸、40-80mg/ L丝氨酸、200_300mg谷氨酸、40_80mg/L甘氨酸、50-100mg/L缴氨酸、100_200mg/L蛋氨酸、 100_200mg/L 异亮氨酸、30_50mg/L 亮氨酸、100_200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 赖氨酸、20-5011^/1^组氨酸、100-15011^/1^精氨酸、50-10011^/1^脯氨酸、180-30011^/1^天冬酰胺、1000-1200mg/L谷氨酰胺、10-30mg/L半胱氨酸及30-80mg/L酪氨酸。
[0016] 可用于本发明的维生素包括，0 · 1-0.3mg/L生物素、5-10mg/L泛酸、l〇-15mg/L烟 酸、0 · 1-0 · 5mg/L对氨基苯甲酸、0 · 5-0 · 8mg/L维生素 BI、l-3mg/L维生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L维 生素 BI2、I_3mg/L核黄素、0 · I-0 · 4mg/L叶酸、15_20mg/L氯化胆碱。
[0017]本培养基含有5-lOg/l无机盐。可用于本发明的无机盐包括，200-800mg/L氯化钙、 800-1200mg/L 硫酸镁、500-800mg/L 氯化钾、400-1000mg/L 碳酸氢钠、1500-3000mg/L 氯化 钠、800-1200mg/L磷酸二氢钠;含于1000X浓缩液的0 · 005-0 · OlSmg/!六水合氯化钴、0 · 0 ΙΟ · 05mg/L 二 水合氯化铜、0 · 001-0 · 01mg/L四 水合氯化锰、0 · 05-0 · 20mg/L 氯化锌、0 · 1-0.2mg/L七水合硫酸亚铁、0.001-0.01mg/L七水合钼酸铵。
[0018]酵母提取物(Yeastolate，YL)是昆虫细胞培养基的基本成分，它是维生素和嘌呤 的主要来源，本发明中可包含，例如，5-10g/L的酵母提取物。
[0019] 本发明的无血清完全培养基还包含其它成分，例如，5-15ml/L的脂质乳化剂和Ig/ L的防起泡剂Kolliphor K188。
[0020] 培养基的配制相对而言较为简单，配制方法并不唯一。例如，培养基可通过下面所 述的方法制备，将所有成分及附加物先以各自合适浓度溶解于水，调节pH至合适值，然后加 压使溶液通过一个薄膜滤器而获得无菌无支原体的培养基。
[0021] 在一个实施方式中，本发明提供了一种用于悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基， 所述的无血清培养基包含5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L无机盐、0.01~ 0.05g/L维生素、5~10g/L酵母提取物以及10-20ml/L的脂质乳化剂。
[0022] 在另一实施方式中，本发明所述的碳水化合物不包含蔗糖和麦芽糖等多糖。
[0023] 在另一实施方式中，本发明的无血清培养基不含胱氨酸、丙氨酸和羟脯氨酸。
[0024]在另一实施方式中，本发明的无血清培养基含有1.0-1.2g/L的谷氨酰胺。
[0025] 本发明所涉及的培养基所含成分种类少，含量低，配制简单，且能够达到和商业化 培养基相同的效果。所有成分均为简单易得试剂，购买方便，成本低廉。与组成类似的另一 种动物细胞培养基（公开号为CN101988047)相比较，本发明所述培养基所含氨基酸成分显 著减少，价格较高的酵母提取物显著减少，脂质体为自制，仅维生素的成分有所增加，因此 培养基的生产和配制更加方便。以所有成分均采用Sigma、BD和国药集团化学试剂公司产品 为例，本发明所述培养基成本相比较进口同类产品大约降低70%以上，具有良好的商业化前 景。与国外经典产品相比，本培养基可直接用于柱上纯化，无需浓缩等其它处理步骤，非常 方便表达产物后续处理。
[0026] 与传统的添加血清成分的培养基相比较具有成本低、易于配制，无动物源性污染、 批次稳定等特点，与一般的商业化培养基相比较，能悬浮培养细胞，提高表达量，更适合于 大规模生产应用，有利于重组蛋白的稳定获得。
【附图说明】
[0027]图1:自制的NB-SFM培养基与SF900 III培养基悬浮培养SF9细胞，对比培养效果图 图2:自制的NB-SFM培养基与商业化培养基悬浮培养High Five细胞，对比培养效果图。
【具体实施方式】
[0028]以下为结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，并不对 本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本发明的保护范围之内，本发 明实施例所用试剂，如未特殊说明，均购自生化试剂供应商，所用实验技术，如未特别说明， 均为常规技术。
[0029]本发明培养基命名为NB-SFM。下列实施例用于阐明本发明的某些优选实施方案， 不应解释为限制了它的范围。实施例中氨基酸购自TCI，无机盐和维生素购自国药公司和 Sigma，其它成分购自Sigma和BD。其中所用商业化培养基为SF900III和Express Five，购自 Life Technologies公司。细胞株SF9和High Five购自ATCCt3HISF细胞由本实验室构建。在 细胞培养实验中，细胞密度通过血球计数板计数，细胞活性通过台盼蓝染色法确定。
[0030]实施例1:本发明所述的无血清培养基的配制 (1)称量 按照表1、表2、表3准确称取原料： 表1氨基酸
表3无机盐
表4所列成分称取完毕后，用ImL乙醇将上述成分溶解，然后再加热(45-50Γ)的条件下 缓慢滴加9mL水，使之缓慢形成乳化物，使用前加入培养基。
[0031]表5其它成分
(2)溶解 将原料(表1，表2，表3，表5)放到一个大的烧杯中，取800mL超纯水放到烧杯里，搅拌直 至溶解完全，将表4配制出的溶液加入烧杯中，用IOM的氢氧化钠调节培养基pH至6.3，添加 超纯水使总体积达到l〇〇〇mL。
[0032]实施例2:本发明培养基与进口同类产品培养效果比较 按照常规方法，用自制的NB-SFM培养基与SF900 III培养基悬浮培养SF9细胞，对比培 养效果(附图1)。从图1可看出，在同样的培养时间内，两种培养基SF9活细胞密度一致，没有 明显差异。
[0033]同样按照常规方法，用自制的NB-SFM培养基与商业化培养基悬浮培养High Five 细胞，对比培养效果(附图2)。从图2可看出，在同样的培养时间内，两种培养基High Five活 细胞密度一致，没有明显差异。
[0034] 实施例3:自制培养基和商业化培养基培养感染后的昆虫细胞 按照常规方法，利用自制培养基和商业化无血清培养基培养杆状病毒感染后的 胞96h后，测定病毒滴度，比较两种培养基的培养效果(表6)。由表6可知，自制无血清培养基 病毒滴度明显高于商业化培养基。
[0035] 表6杆状病毒感染细胞培养96h后病毒滴度的比较
实施例4:自制培养基和商业化培养基培养表达流感血凝素蛋白比较 按照常规方法，利用自制培养基和商业化无血清培养基培养培养流感血凝素表达蛋白 细胞，收集蛋白后测定并比较血凝滴度。根据血凝滴度确定两种培养基培养效果(表7)。由 表7可知，自制无血清培养基血凝滴度明显高于商业化培养基。
[0036] 表7流感病毒血凝素蛋白表达的比较
虽然上面的举例了一些特定实施例来说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅局限 于其中的各种细节。相反地，在等价于权利要求书的范畴和范围内可以不偏离本发明精神 地在各种细节上做出各种修改。
【主权项】
1. 一种用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于所述的无血清培养基包含 5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L无机盐、0.01~0.05g/L维生素、5~10g/L酵母提 取物以及10_20ml/L的脂质乳化剂。2. 根据权利要求1所述的用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所用的 氨基酸可包括150_250mg/L天冬氨酸、20_50mg/L苏氨酸、40_80mg/L丝氨酸、200_300mg谷氨 酸、40_80mg/L 甘氨酸、50-100mg/L 缴氨酸、100_200mg/L 蛋氨酸、100_200mg/L 异亮氨酸、30-50mg/L 亮氨酸、100-200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 赖氨酸、20_50mg/L 组氨酸、100-150mg/L 精 氨酸、50-100mg/L 脯氨酸、180-300mg/L 天冬酰胺、1000-1200mg/L 谷氨酰胺、10-30mg/L 半胱 氨酸及30-80mg/L酪氨酸。3. 根据权利要求1所述的用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所用维 生素包括〇· 1_〇 · 3mg/L生物素、5-10mg/L泛酸、10_15mg/L烟酸、0 · 1-0 · 5mg/L对氨基苯甲酸、 0 · 5-0 · 8mg/L维生素 Bl、l-3mg/L维生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L维生素 B12、Umg/l核黄素、0 · ΙΟ · 4mg/L叶酸、 15-20mg/L 氯化胆碱。4. 根据权利要求1所述的用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所用无 机盐可包括 200-800π^/1 氯化钙、800-1200mg/L 硫酸镁、500-800mg/L 氯化钾、400-1000mg/L 碳酸氢钠、1500-3000mg/L氯化钠、800-1200π^/1磷酸二氢钠;含于1000X浓缩液的0.005-0 · 015mg/L六水合氯化钴、0 · 01-0 · 05mg/L二水合氯化铜、0 · 001-0 · 0 lmg/1四水合氯化锰、 0 · 05-0.20mg/L氯化锌、0· 1-0.2mg/L七水合硫酸亚铁、0· 001-0.01mg/L七水合钼酸铵。5. 如权利要求1-4所述的用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基在悬浮培养昆虫细胞 中的应用。
【文档编号】C12N5/07GK105861415SQ201610225157
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】杨春江, 赵荣茂, 马孝斌, 秦堃, 莫勋, 吴迪
【申请人】北京瑞鹰生物技术有限公司