专利名称：粉纹夜蛾细胞系的克隆株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫细胞系的克隆株，尤其涉及粉纹夜蛾细胞系的一个新克隆株，本 发明还涉及该克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途，属于昆虫细胞生物学和生物技 术领域。
背景技术：
自 1962 年 Grace 建立了第一个昆虫细胞系以来(Grace Τ. D. C. 1962, Nature, 195 :788-789)，利用Grace的昆虫细胞培养基或改良的Grace培养基已在100余种昆虫 中建立了 600 余株昆虫细胞系(Chih-Yuffu,2006, J. Invert. Pathol. ,93 186-191)。昆虫 细胞系最初用于昆虫病毒的研究，随着研究的不断开展，昆虫细胞应用范围不断扩大，特 别是杆状病毒一昆虫细胞表达载体系统(Thebaculoviruses—insect cell expression system)的发明，使其成为广泛应用于真核蛋白表达最有效的手段之一(Summers，M. D.等， 1987，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin, 1555 ；O^reillyiD.R.等，1992， Baculoviruses Expression Vector :A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York, NY, USA)，该系统的优点是杆状病毒载体能诱导大量重组蛋白产生，而昆虫细胞 又有加工蛋白的能力，同时昆虫杆状病毒对哺乳动物安全。但是由于这些蛋白生产是在病 毒侵染后在寄生细胞内持续进行，所以寄主细胞的生理特性(悬浮或贴壁性状，分泌能力 和翻译水平等)可直接影响蛋白表达或病毒产量。目前人们已利用几种昆虫细胞系成功的表达和生产多种病毒和重组蛋白(前列 腺癌，淋巴癌，宫颈癌，肝炎等疾病的疫苗)(Granados，R. R等，1994，J. Invert. Pathol.， 64 -.260-266 ；Altman, F.等 1999, Glycoconj, J. ，16 109-123 Jarvis, D. L. ，1997, in L.Miller 等，The Baculoviruses :389_431，Plenum Press. NY，USA)。虽然目前已建立 600 余株细胞系，但由于其特性不同，包括生长特性，对病毒的受纳性，重组蛋白表达等，适合上 述应用条件的细胞株还很少。目前仅限于草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-21及其克隆株Sf-9 和粉纹夜蛾细胞株 ΒΤΙ-Τη5Β1-4(商品名称 High Five 即 Hi 5) (Gardiner, G. R.，1975， J. Invert. Pathol. ,25 :363_369 ； 1970，J Invert. Pathol.，16 :284_228 ；Vaughn, J. h.等， 1977，In Vitro. 13 :213_217)。Tn5Bl_4 细胞是从 Tn5Bl 中克隆出的新细胞系(Granados, R. R.，等 1986 Virology, 152 :472_476 ； 1994，J. Invert. Pathol.，64 :260_266)，Τη5Β1_4 细 胞与Sf-21和Sf-9细胞比较，它具有对AcMNPV病毒更敏感，产量高，对多种重组蛋白有高 表达水平。最近又通过对Τη5Β1-4细胞的进一步克隆，获得两个新细胞克隆株H5CL-B和 H5CL-F (Li Guoxun 等，2003，Bioprocessing, 2 (1) :58_62)，它们比野生型细胞 Τη5Β1_4 有 更优良的特性，其重组蛋白表达可提高1-2倍。从中可以看出，对已建立的细胞系进行再克 隆和筛选，仍然可以获得更优良的新克隆株。虽然上述细胞系目前被广泛应用，但还存在某些缺点而影响产量和表达，因此，需 要不断改善。首先Sf-21和Sf-9细胞系无论在病毒产量(OB)和重组蛋白表达都远不如 Τη5Β1-4细胞，而Τη5Β1-4细胞虽然有较高的病毒产量和重组蛋白表达水平，但由于培养过程中有很强的贴壁特性而大量结块，不适于悬浮大量培养，而影响病毒产量和重组蛋白表 达。本发明人新建立了一株悬浮培养细胞系QB-TN9-4S(Ming Mengjuan等，2008，Inseet Science, 15 :423_428)，该悬浮培养细胞系虽然有更好的性状，但该细胞系来自于胚胎，细 胞组分复杂，个体间的特性差异很大，使这一混合细胞群体不能发挥某些个体的更优良特 性。为此，对这一细胞系进行克隆和筛选。
发明内容
本发明所要解决技术的问题是目前所使用的细胞系Sf-21，Sf-9和HighFive在培 养过程中由于强烈贴壁而不适于悬浮大量培养从而影响病毒和重组蛋白生产的问题，筛选 出一株粉纹夜蛾细胞系的克隆株，从而克服悬浮培养中细胞聚结成块问题，进一步提高表 达水平。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一株粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系的克隆株(QB-TN9-4S-CL-B)，其微生物 保藏号是CCTCC C201046 ；分类命名是粉纹夜蛾；保藏时间是2010年5月24日；保藏单 位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是武汉大学；利用细胞克隆是改善细胞，筛选具有更优良特性的新细胞系良好途径。为此，本 发明通过细胞克隆的方法，筛选出新的细胞克隆株(QB-TN9-4S-CL-B，简称为“QB-CL-B”)。 本发明所克隆的细胞克隆株在完全培养基(TNM-FM)中培养，其形态特征在对数生长期与 野生型细胞差别不明显，以梭形细胞为主(80%以上)。从细胞的生长特性可以看出，该细 胞克隆无紧密贴壁特性，为悬浮细胞克隆株，在悬浮培养时不结成团，有利于病毒附着和侵 染，同时能提高病毒及重组蛋白的生产。比目前广泛应用的High Five细胞有明显的改善。 QB-TN9-4s-CL-B细胞株生长最大密度在第五天达到1. 55X IO6细胞/ml，略高于野生型和 High Five细胞系。该克隆株的群体倍增时间与High Five和野生型细胞比较无明显差异。本发明细胞克隆株对AcMNPV病毒高度敏感，可与High Five细胞相比较，该克 隆株的多角体(OB)产量显著高于广泛应用的SF-9细胞，为Sf-9细胞的2. 9倍(平均为 1050Bs/细胞)。为病毒杀虫剂生产提供良好的资源，与利用Sf-9细胞生产比较，可大大降 低生产成本。本发明的细胞克隆株与野生型细胞和High Five细胞相比较，表现显著的高表达 水平，其中重组蛋白β "gal表达约是上述细胞的1. 2倍和2. 0倍(第6天)；而SEAP的表 达分别为上述细胞的3.0倍和1.2倍(第7天)。是某些重组蛋白生产的良好载体，也是 High Five细胞的良好替代产品。本发明的细胞克隆株可应用于生产重组蛋白或杀虫病毒，包括构建含有目的基 因的重组表达载体或重组病毒；将该重组表达载体或重组病毒转化到所述的细胞克隆株 中，进行悬浮培养。所述的重组蛋白可以是重组β -半乳糖苷酶(β -galactoridase)或重组碱性磷 酸酶(secreted SEAP)；或者是农业，医药或其它领域中所需要的蛋白。所述的杀虫病毒包括能感染该细胞的所有昆虫病毒，优选的，所述的杀虫病毒是 作为生物杀虫剂的Y纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)。
图1细胞的形态特征Α.野生型细胞QB-Tn9-4s ；B.克隆株QB-TN9-4s-CL_B ； C. Tn5Bl-4 (High Five)细胞。图 2 生长曲线野生型细胞 Q B-TN9-4S，克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl_4(High Five)细胞。图3病毒感染Α.野生型细胞QB-Tn9-4s ；B.克隆株QB-TN9-4s-CL_B ； C. Tn5Bl-4 (High Five)细胞。图 4β -galactoridase 表达野生型细胞 QB-TN9-4S，克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl-4(High Five)细胞。图 5secreted SEAP 表达野生型细胞 QB-TN9-4S，细胞克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl-4(High Five)细胞。图6利用4种引物进行DNA分析引物:A.引物0PU-09 ；B.引物0PU-10 ；C.引物No. 2 ；D.特异性引物T. ni ；样本1. DNA分子量标准；2.粉纹夜蛾卵的DNA ；3.野生型QB-Tn9_4s的DNA ；4.克 隆株 QB-Tn9-4s-CL-B 的 DNA ；5. Tn5Bl-4 (High Five)的 DNA ；6. Sf-9 的 DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1细胞克隆株QB-TN9-4S-CL-B (QB-CL-B)的分离克隆及鉴定1. 1粉纹夜蛾细胞系QB-TN9-4S的建立按照Ming-Juan Meng的方法(2008， Insect Science, 15 :423_428)，取实验室培养的粉纹夜蛾种群的新鲜卵，分别用10%次氯 酸钠和75%酒精表面消毒5分钟，再用TNM-FH(GIBCO，USA)培养基洗两次后，卵被转移到 一个细胞滤网器(BD Falcon,USA)并将滤网器放入有IOml培养基的平皿中，将细胞充分磨 碎后，将卵组织滤液稀释成不同浓度，分装于25cm2的培养瓶(Corningjew York,USA)中。 置28°C培养。每2周更换一半新鲜培养基。5个月后，当形成的细胞铺满瓶底后进行第一 次传代，待细胞生长稳定后，每周传代两次。1. 2 细胞克隆按 Guoxun Li 等的方法(2003，Bioprocessing，2 (1) :35_38)，将 91 代野生型细胞QB-TN9-4S培养三天，悬浮并用血球计数板计数，将细胞稀释到需要的浓度， 然后将该细胞悬浮液加入到细胞克隆板(Greiner Labotechnik, Germany)中，28°C静置培 养2小时后，在倒置相差显微镜下(Olympus，1X71. Japan)观察，并标记下该克隆版中只有 一个细胞的所有小方格，每天观察这些细胞的生长情况和分裂情况。待细胞增殖到铺满小 格底部时，用移液枪头小心吸出，转入96孔板中继续培养，细胞铺满小孔底部后，再转入24 孔板中，同样，待铺满底部时，在转入25cm2培养瓶中，按常规进行培养，即获得细胞克隆株。1 · 3细胞基因组DNA的RAPD-PCR分析参照Mingjuan Meng 的方法(2008，Insect Science, 15 :423_428)，利用 DNA 纯 化试剂盒(Τ0Υ0Β0 Osaka, Japan)，按说明书的步骤和方法，提取各样品的DNA。选择4种随机引物进行 RAPD-PCR 鉴定0PU-09(5，-CCACATCGGT-3，) ；OPU-IO (5‘ -ACCTCGGCAC-3，) [Wu&Wang，2006] ；Primer No.2(5， 一CCGCATCTAC—3， )[Kawai&Mitsuhashi，1977],禾口 T. niSpecific primer (5，-TTGCTGTCCA-3，)[Lietal. 2003]·该 PCR 产物通过 1. 2% 的琼月旨 糖电泳分析。试验结果见图6。1. 4细胞克隆株的形态和生物学特性a.细胞形态细胞在完全培养基ΤΝΜ- 中，28°C条件下培养3天，正置对数生长 期。在倒置相差显微镜(Olympus，1X71，Japan)下观察细胞形态，贴壁或悬浮情况，测定细 胞大小。
细胞克隆株在完全培养基(TNM-FM)中培养，在对数生长期与野生型细胞形态差 别不明显，以梭形细胞为主(80%以上)。QB-CL-B的大小为18. 4X49. 4mm，略大于目前广 泛应用的High-five细胞系(16. 6X38. 4mm)这也是它具有高产特性的原因之一(图1)。b.细胞生长按 Robert R. Granados.的方法(1994，J. Invert. Pathol. ,64 260-266)，测定细胞生长曲线和群体倍增时间。将对数生长期的细胞按1.0 X IO6细胞/5ml 培养基的浓度接入25cm2培养瓶中，28°C条件下培养，每24小时取样测定细胞浓度。根据 记录结果绘制细胞生长曲线，并按公式T = l/K(log N = LogN0+K+log2)计算出群体倍增 时间(T)从细胞的生长特性可以看出，该细胞克隆株无紧密贴壁特性，为悬浮细胞克隆，在 悬浮培养时不结成团。有利于病毒附着和侵染同时能提高病毒及重组蛋白的生产。与目 前广泛应用的High Five细胞有明显的改善。QB-CL-B细胞生长最大密度在第五天达到 1.55 X IO6细胞/ml略高于野生型和High Five细胞系。细胞克隆株的群体倍增时间与High Five和野生型细胞比较无明显差异(图2)。试验例1本发明克隆株的病毒感染滴度(TCID50)和多角体(OB)产量测定根据PingWang 的方法(1992，J. Invert. Pathol. ,59 :46_53)，利用 AcMNPV-lA (苜 蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒)为毒源(Boyce Thomason Institate,Cornell University, Ithaca，NY，USA)，以 MOI = 10 (Multiplicity oflnfection)的感染指数接种对数期细胞， 28°C下培养，每天观察感染状况，3天后将其悬浮，离心后，上清样品用于测定滴度；培养4 天后，多角体完全形成，细胞尚未破裂时，在显微镜下观察并计算感染率。最后用超声波裂 解细胞，释放出全部多角体后，用血球计算板计数可获得多角体产量(OBs/ml)。试验结果本发明细胞克隆株QB-CL-B对AcMNPV病毒敏感性和High Five细胞 比较无明显差异。在感染后4天测定。感染率平均在94%以上。此时QB-CL-B细胞已有 50%细胞裂解，并释放出多角体到培养基中。出芽性病毒(BV)的产量，细胞株间差异不显 著，约为3.0X107TCID50/ml.细胞克隆株的多角体(OB)产量显著高于广泛应用的SF-9细 胞(37. 60Bs/细胞)，为Sf-9细胞的2. 9倍(平均为1050Bs/细胞)。为病毒杀虫剂生产 提供良好的资源。与利用Sf-9细胞生产比较，可大大降低生产成本(图3)。试验例2重组蛋白在本发明细胞克隆株中的表达试验一、试验方法按照Wickham 和 David 的方法(1992，Bio/technology, 10 1148-1150 ； 1993， In Nitro Cell Dev. Biol. 29A :388_390)，重组蛋白碱性磷酸酶(SEAP)和半乳糖苷酶 β -galactoridase ( β -gal.)表达水平被测定。
a. SEAP表达的测定将对数生长期的细胞按2. 0 X IO5细胞/孔的量接 入24孔板中，待细胞沉淀瓶底时，轻轻吸除培养基。按MOI = 10的侵染指数接入 重组病毒AcMNPV-SEAP，每24小时取样，在0D405的光密度下测定表达量，根据公式
权利要求
一株粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系的克隆株，其微生物保藏号是CCTCC C201046。
2.权利要求1所述的克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于直接利用杀虫病毒感染所述的细胞克隆 株，进行悬浮培养，进行杀虫病毒的大量生产。
4.按照权利要求2所述的用途，其特征在于构建含有目的基因的表达载体或重组病 毒，将该重组表达载体直接转化到所述的细胞克隆株或用重组病毒侵染所述的细胞克隆 株，然后悬浮培养，生产重组蛋白。
5.按照权利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的重组蛋白是半乳糖苷酶 或其他用途的重组蛋白。
6.按照权利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的重组蛋白是碱性磷酸酶。
7.按照权利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的杀虫病毒是Y纹夜蛾核型多 角体病毒或其它种类的杀虫病毒。
全文摘要
本发明公开了粉纹夜蛾细胞系的克隆株及其用途。本发明细胞克隆株的微生物保藏号是CCTCC C201046；本发明克隆株无紧密贴壁特性，在悬浮培养时不结成团，有利于病毒附着和侵染从而显著提高病毒及重组蛋白的产量，与野生型细胞(QB-TN9-4s)和目前国际上广泛应用的High Five细胞比较，表现显著的高表达水平，其重组蛋白表达是上述细胞的1.2-3.0倍，本发明克隆株可应用于生产重组蛋白或杀虫病毒。本发明克隆株对病毒敏感性及病毒产量都很高，可与High Five细胞相当，但该克隆株的多角体产量显著高于另一个广泛应用的SF-9细胞，为Sf-9细胞的2.9倍。
文档编号C12N5/07GK101935634SQ201010194398
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者吴艳蕾, 周洪旭, 姜磊, 崔英伟, 李国勋, 李淑文, 李长友, 郑桂玲, 马明 申请人:青岛农业大学