用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种用于人免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合。
技术背景
[0002]随着生物治疗肿瘤技术的发展，生物治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后肿瘤治疗的第四种治疗方式。在肿瘤的生物治疗中免疫细胞治疗是重要的一环，近年来，免疫细胞治疗已在临床中显示出了重要的应用价值。
[0003]所述免疫细胞治疗包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的治疗。其中，以自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)为主体的肿瘤过继免疫治疗已逐渐成为肿瘤生物治疗中最活跃的应用与研究项目之一。
[0004]过继免疫治疗在实施过程中很重要的一个环节就是要通过免疫细胞的体外扩增，使免疫细胞数量符合临床注剂量要求后输给患者，达到生物治疗的目的。由于生物治疗的特殊性在于，是以免疫细胞作为治疗药物输入患者体内的，因此，体外扩增免疫细胞的安全性和质量的稳定性就显得尤为重要。在免疫杀伤细胞的体外扩增过程中需要确保不能渗入任何可能会给患者生命带来安全风险的物质，例如异源病原菌和病毒。
[0005]常规的细胞培养是在有血清的体系中进行，异源血清的加入可能会增加异源感染的风险，这在临床上是不允许的。使用无血清培养基，即采用血清替代物组合替代血清在细胞培养中的作用来进行无血清扩增，则正好能解决上述问题，因此，将无血清培养基用于免疫杀伤细胞的体外扩增就显得尤为重要。由于无血清培养基相比于有血清培养体系成分更加明确，批次间质量更加稳定，且易于规模化制备和管理，易于规避异源物质的干扰，其质量的稳定性和使用的安全性都会有大幅度提尚。
[0006]然而，由于血清组成复杂多样，包含多种生长因子、蛋白、激素及其他小分子物质，它们对免疫细胞体外扩增的作用也不尽相同。为此，研究血清中各种组分以及组分之间的相互作用对细胞增殖的影响，分析和发现其中对细胞生长增殖有显著促进作用的关键物质，通过科学实验优化其浓度范围，制备出血清替代物，是建立无血清培养基的关键环节。根据2012年由Sunghoon Jung, KrishnaM.Panchalingam, Lawrence Rosenberg和Leo A.Behie发表于Stem Cells Internat1nal期干丨J上的《Ex Vivo Expans1n of HumanMesenchymal Stem Cells in Defined Serum-Free Media》(用成分明确的无血清培养基体外扩增人间充质干细胞)，2012，Stem Cells Internat1nal，细胞培养中所常用的胎牛血清的组成及其浓度范围如下:
成分_浓度范围
蛋白和多肽40?80mg/mL
白蛋白20?50 mg/mL
胎球蛋白10?20 mg/mL纤粘连蛋白1.0?10 yg/mL
球蛋白1.0?15mg/mL
蛋白酶抑制剂0.5?2.5mg/mLα I?抗胰蛋白酶α2?巨球蛋白转铁蛋白2.0?4.0mg/ml生长因子:
EGF，PDGF，IGF1 和2，1.0?100ng/mLFGF，IL?I，IL?6
氨基酸0.01?1.0μΜ
脂类2.0?10mg/mL
胆固醇10μΜ(3.8665mg/mL)
脂肪酸0.1?1.0μΜ
亚油酸0.01 ?0.1μΜ(0.0028 ?0.028mg/mL)
磷脂0.7?3.0mg/mL
碳水化合物1.0?2.0mg/mL
葡萄糖0.6?1.2mg/mL
氨基己糖0.6?1.2mg/mL
乳酸0.5?2.0mg/mL
丙酬酸2.0?10yg/mL
聚氨0.1?:LOyM
腐胺、亚精胺尿素170 ?300yg/mL
无机物0.14?0.16Μ
?丐4.0?7.0mM
氯ΙΟΟμΜ
铁10?50μΜ
钾5.0?15 mM
磷2.0?5.0 mM
砸Ο.ΟΙμΜ
钠135?155 mM
锌0.1?1.0μΜ
激素0.1?200ηΜ
氢化可的松10?200ηΜ
胰岛素1.0?100ng/mL
三碘甲状腺氨酸20 nM
甲状腺素100 nM
维生素0.01?10yg/mL
维生素A10?100ng/mL 叶酸5.0?20ng/mL。
[0007]在上述胎牛血清的组分中，蛋白质、生长因子、脂类、激素和聚氨等组分很少出现在普通的商业基础培养基中，而这些组分又是免疫细胞生长增殖所必须的关键组分。
[0008]在无血清培养基需要添加的蛋白质类物质中，最重要的是白蛋白和转铁蛋白。所述白蛋白能与脂类、激素、维生素、金属离子和生长因子等结合，起到调节上述物质在无血清培养基中浓度和活性的作用。所述转铁蛋白与细胞上的转铁蛋白受体结合是细胞获取铁元素的主要来源，而铁离子在多种代谢途径中起着重要的作用，其与氧的转运、DNA的合成和电子转移密切相关。
[0009]对于不同种类的细胞进行增殖需要添加的生长因子种类也是不尽相同的，例如在T淋巴细胞培养过程中是添加IL-2作为生长因子的。对于很多生长因子而言，它们不是直接被添加到初始培养基里的，而是在培养过程中另外添加的，因此，生长因子的作用可以不作为无血清培养基考虑的范围。
[0010]激素中最重要的是胰岛素和氢化可的松。胰岛素可与细胞上的胰岛素受体结合后促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞的凋亡。氢化可的松可以抑制由巨噬细胞释放的有毒性的氧自由基和蛋白酶，也可以抑制由单核细胞释放的有毒的超氧化物自由基的生成。
[0011]脂类中的脂肪酸、胆固醇和磷脂参与细胞膜结构的合成，是细胞生长必不可少的营养成分。脂肪酸中包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸如棕榈酸、月桂酸、豆蔻酸等，不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸和亚麻酸等。磷脂包括磷脂酰胆碱(卵磷脂)和磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)，胆碱和乙醇胺分别是合成二者的单体物质。
[0012]聚氨包括腐胺、精胺和亚精胺，这些物质可作为激素信号通路的第二信使，调节细胞渗透压，影响细胞的生长增殖和细胞功能。
[0013]除了这些关键成分外，还有小分子物质，如α-硫代甘油和β-巯基乙醇，也是调节细胞生长代谢的重要组分。
[0014]但是研究发现，只是简单地将上述成分组合在一起并不能有效支持细胞的生长增殖。这是由于上述蛋白质、脂类等物质的种类或者部分成分浓度并不适宜此类细胞的生长增殖或者其本身可能会有抑制作用。
【发明内容】
[0015]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，它组分明确，可添加到不同基础培养基中，能支持免疫杀伤细胞的体外高效扩增，具有高效性和普适性。
[0016]本发明通过科学的实验设计方法-部分因子实验设计和响应面分析，经多次实验重复，从众多候选物中逐步分析优化，最终筛选出数种可支持免疫细胞体外高效扩增的血清替代物组合。
[0017]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
[0018]—种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，其成分组成包括:胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、乙醇胺、α-硫代甘油、亚麻酸、胆固醇。
[0019]可选的，所述各成分添加到常规培养基中的最终浓度为，单位毫克/升: 胰岛素0.5?20mg/L;
转铁蛋白0.69?22mg/L;
牛血清白蛋白3000?6000mg/L;
乙醇胺0.61 ?2.44mg/L;
α_ 硫代甘油5.41?10.82mg/L;
亚麻酸0.5?5.0mg/L;
胆固醇0.8?20mg/L。
[0020]进一步，在所述血清替代物组合基础上能再添加柠檬酸铵铁、β_甘油磷酸二钠和腐胺;所述柠檬酸铵铁、甘油磷酸二钠和腐胺添加到常规培养基中的最终浓度为(单位毫克/升):柠檬酸铵铁0.46?2.3mg/L ； β-甘油磷酸二钠300?1500mg/L ；腐胺0.25?I.25mg/L0
[0021 ] 一种用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合，其特征在于，其各种成分添加到常规培养基中的最终浓度为，单位mg/L:
胰岛素0.5?20mg/L;
转铁蛋白0.69?22mg/L;
牛血清白蛋白3000?6000mg/L;
乙醇胺0.61 ?2.44mg/L;
α_ 硫代甘油5.41?10.82mg/L;
亚麻酸0.5?5.0mg/L;
胆固醇0.8?20 mg/L；
柠檬酸铵铁0.46?2.3mg/L;
甘油磷酸二钠 300?1500mg/L;
腐胺0.25?1.25mg/L。
[0022]本发明用于免疫杀伤细胞体外扩增的血清替代物组合的积极效果是:
(I)组分明确，有利于免疫细胞的体外扩增，能促进肿瘤的生物治疗，尤其是体细胞治疗的进行。
[0023]( 2 )研究还发现，本发明的血清替代物组合，可加入到不同基础培养基，如RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基和IMDM培养基中，能支持免疫细胞的高效增殖。
[0024](3)实验证明:本发明的血清替代物组合具有高效性和普适性，容易配制、成本可控，容易实施和推广应用。
【附图说明】
[0025]附图1为实施例1细胞扩增倍数的比较图。
[0026]附图2为实施例2细胞扩增倍数的比较图。
[0027]附图3为实施例3细胞扩增倍数的比较图。
[0028]附图4为实施例4细胞扩增倍数的比较图。
[0029]附图5为实施例5细胞扩增倍数的比较图。
[0030]附图6为实施例6细胞扩增倍数的比较图。
[0031 ]附图7为实施例7细胞扩增倍数的比较图。
[0032]附图8为实施例8细胞扩增倍数的比较图。
[0033]附图9为实施例8所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
[0034]附图10为实施例9细胞扩增倍数的比较图。
[0035]附图11为实施例9所扩增的细胞中各类免疫细胞的比例图。
[0036]附图12为实施例9对肿瘤细胞K562的杀伤活性的比较图。
[0037]附图13为实施例10细胞扩增倍数的比较图。