专利名称：细胞培养用人血清的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养用人血清，更详细地说是涉及大量含有细胞生长因子的细胞培养用人血清。
本申请要求2004年11月19日在日本申请的专利申请号2004-335344号的优先权，通过在这里引用该申请的内容而将其并入至本申请中。
背景技术：
现在，在再生医疗领域中正在进行通过在使采集于对象者的干细胞在体外增殖或分化的基础上移植到对象者中来促进对象者的组织的再生的研究。干细胞具有分化成各种组织和器官的多分化功能，作为把握再生医疗关键的细胞而备受关注。
已知，在干细胞的体外培养增殖中，如果在培养基中加入血清，则具有效果，但以治疗人为目的时，从安全性的问题上出发应该避免使用来自于人以外的动物的血清，要求使用由来自于人、特别是采集于对象者的血液调制的血清。另外，与血液检查相比，在再生医疗领域的干细胞培养中需要更多的血清。
作为调制这种血清的方法，例如公开了使用收纳有由玻璃粉末形成的血液凝固促进个体的采血管的方法(参照专利文献1)。另外，还公开了为了迅速地分离混入在血清中的纤维蛋白等凝固物质，使玻璃粉末与血液相接触，从而容易地将含有多种大量生长因子的血清回收的方法(参照专利文献2)。另外，还公开了以人血浆为原料进行制造的方法(参照专利文献3)。进而，还公开了在血浆中添加钙化合物和玻璃珠来获得生长因子的方法(参照专利文献4)。
但是，专利文献1和2中公开的方法由于使用了以血液检查为目的的容量较小的采血管，因此为了调制干细胞培养所必需的量的血清，必须进行多次调制操作，不适于实用。另外，专利文献3中公开的方法由于使用凝血酶作为抗凝固剂，因此在使用生物来源的制品所导致的感染危险残留的方面来看不优选。进而，专利文献4中记载的方法由于将仅少量含有细胞生长因子的血浆作为原料，因此所得血清没有含有充分的细胞生长因子，因而不能高效地培养干细胞。
专利文献1日本特开2000-000228号公报专利文献2日本特开平4-83165号公报专利文献3日本特开2001-275662号公报专利文献4日本特开2004-269409号公报发明内容鉴于上述课题，本发明的目的在于提供大量含有能够高效地促进干细胞增殖的生长因子的血清。
更具体地说，本发明提供以下内容。
(1)一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，采血后的20分钟以内的血小板残存率超过总血小板的0％但为20％以下，且细胞生长因子的释放率为20％～100％。
根据(1)的发明，通过使采血后的20分钟以内的血小板残存率超过总血小板量的0％但为20％以下，可以迅速地促进细胞生长因子的释放。另外，通过使细胞生长因子的释放率为20％～100％，可以高效地使干细胞增殖。另外，通过使用至少含有血液来源的液体成分和血小板的流体，能够生成含有比从血浆调制的量更多的生长因子的血清，从而能够制造具有与胎牛血清同等的细胞增殖效果的血清。
这里，所谓的“血液”是指含有血球(红血球、白血球、血小板)和作为液体成分的血浆(血清)构成的全血，以及含有其中至少1种的液体(例如在成分献血中采集的血液)。另外，“血清”是指放置采集的血液时流动性降低、之后从红色凝固块(血饼)中分离出来的淡黄色液体。本发明中的“血清”是指虽然在不能从血饼中分离出来的方面来看，其生成方法与普通的血清不同，但其所含有的凝固因子或生长因子基本上与普通血清相同的对细胞培养有用的血液中的液体成分。另外，“血液来源的液体成分”是指血球以外的血液成分或者在血球以外的血液成分中添加了抗凝固剂等药剂而得到的混合液。另外，“细胞生长因子”是指血小板生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞成长因子(bFGF)等。
另外，“细胞生长因子的释放率”是指将由采集到真空采血管中的规定量的血液调制的血清中的细胞生长因子量作为潜在量(100％释放)，细胞生长因子相对于该潜在量的比例。
(2)一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，其中，上述细胞生长因子的含量比由血浆调制的人血清更多。
根据(2)的发明，通过使本发明的人血清的细胞生长因子的含量多于由血浆调制的情况，可以高效地使干细胞增殖。这里所说的“血浆”是指在采集的血液中添加肝素或CPD等抗凝固剂后进行离心分离而得到的上清液。所谓的“由血浆调制的人血清”是指在血小板完全沉淀的离心分离条件下(例如4,400(g)×5(min.)以上)从由对象者采集的血液中调制血浆，并除去该血浆中所含的凝固因子，从而获得的人血清。
(3)一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，其中，上述细胞生长因子的含量比通过放置而调制的人血清更多。
根据(3)的发明，通过使本发明的人血清的细胞生长因子含量多于通过放置进行调制的情况，能够高效地使干细胞增殖。这里所说的“通过放置调制的人血清”是指将从对象者采集的血液放置在可挠性容器内，并在室温下放置约1小时后，进行离心分离，从而获得的人血清。
(4)上述(1)～(3)任一项所述的细胞培养用人血清，其中，上述细胞生长因子含有PDGF-BB或TGF-β1中的至少任意一种。
根据(4)的发明，通过在上述细胞生长因子中含有细胞增殖能力较高的PDGF-BB或TGF-β1中的任意一种，可以高效地使干细胞增殖。需要说明的是，PDGF-BB是指PDGF的3种类型(二聚物)(PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB)中的一种。
(5)上述(1)～(4)任一项所述的细胞培养用人血清，其中，上述细胞生长因子通过使上述流体与玻璃加工体相接触而获得。
根据(5)的发明，为了使流体中的血小板活化、从而释放细胞生长因子，必须使该流体与异物相接触。本发明中，通过使该异物为玻璃加工体，可以比聚乙烯颗粒的情况更为高效地释放细胞生长因子。这里所谓的“玻璃加工体”是指玻璃粉末、玻璃珠等。从抑制红血球的破坏(溶血)、抑制调制本发明的血清时所用装置的破损的方面出发，优选该玻璃加工体的形状为大致球状。
另外，为了迅速地使血小板和血液凝固因子等的被活化因子活化，优选用由二氧化硅化合物形成的层来形成玻璃加工体的表面。作为该二氧化硅化合物，可以使用选自玻璃、二氧化硅、硅藻土、高岭土等中的至少1种，但并不限定于此。
(6)上述(5)所述的细胞培养用人血清，其中，上述玻璃加工体为玻璃珠。
根据(6)的发明，通过使玻璃加工体为玻璃珠，可以进一步活化流体中的血小板。特别是多孔质的玻璃珠由于与流体的接触面积大，所以更为优选。另外，玻璃珠的表面积相对于1ml流体优选为0.1(mm2/ml)～25(mm2/ml)。
(7)上述(1)～(6)任一项所述的细胞培养用人血清，其中，在不与外界气体接触的情况下进行调制。
根据(7)的发明，通过在不与外界气体接触的情况下调制人血清，所调制的血清被细菌或微生物等污染的危险性也降低。由此，可以调制安全性高的血清，可以进一步确保安全性。需要说明的是，(7)的发明的人血清优选使用不与外界气体接触那样的装置而调制。
(8)上述(1)～(7)任一项所述的细胞培养用人血清，其用于再生医疗方法中。
根据(8)的发明，通过在细胞培养用的培养基中使用，在接种从对象者采集的干细胞以进行培养时，能够更快地培养细胞。另外，由于可以用自身血清培养细胞，因此产生副作用等的可能性较低，在安全方面上也是优异的。
如上说明，由于本发明的细胞培养用人血清大量地含有细胞生长因子，因此能够比以往血清更高效地培养干细胞。另外，如果将该人血清用于再生医疗中，则能够安全且可靠地再生对象者的组织和功能。
图1为表示调制本发明的细胞培养用人血清的血清调制装置的图。
图2为表示调制本发明的细胞培养用人血清的顺序的图。
图3为使血清调制装置的血液储存部10振荡的图。
图4为表示振荡时间和各试样中的血小板残存率的图。
图5为表示振荡时间和各试样中PDGF-BB的释放率的关系的图。
图6为表示振荡时间和各试样中TGF-β1的释放率的关系的图。
具体实施例方式
以下更加详细地说明本发明。
本发明的细胞培养用人血清优选通过调制用于下述细胞培养方法的血清的细胞培养用的血清调制装置来调制，所述细胞培养方法包括调制含有细胞生长因子的血清的血清调制工序和在所调制的血清的存在下培养细胞的培养工序。
该血清调制装置优选为下述的细胞培养用的血清调制装置具有储存至少包含含有凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体的血液储存部，该血液储存部具有产生适于细胞培养工序的血清的血清生成功能。另外，该血清调制装置进一步优选为封闭体系、即可以在不与外界气体接触的情况下调制血清的装置。这里所谓的血清生成功能是指通过使流体中的血小板活化，使血清中的生长因子含量增加、从而提高血清回收能的功能，该功能通过比重大于流体的凝固促进个体来赋予。
具体地说，优选通过下述血清调制装置来进行调制，但并不特别限定于该装置。
<血清调制装置>
图1所示的血清调制装置1以血液储存部10、成分收纳部20为主要要素而构成。其中，血液储存部10和成分收纳部20由主体部11和插入在主体部11的内部的玻璃加工体12构成，所述主体部11通过在外边缘部11a处将由具有可挠性树脂材料、例如软质聚氯乙烯形成的2张片材熔融粘合而形成为袋状。
在主体部11中，成为凝固促进个体的玻璃加工体12设定为能够在主体部11的内部游动的状态，例如成为由碱玻璃形成的大致球状。需要说明的是，优选使玻璃加工体12的表面积为0.1(mm2/ml)以上的关系的表面积。通过为该范围，促进了血液中血小板和凝固因子的活化。
另外，当使相对于能够储存的血液量的玻璃加工体12的表面积为0.1(mm2/ml)～25.0(mm2/ml)时，能够兼顾抑制在活化促进工序和离心分离工序中的溶血以及促进血小板和凝固因子的活化。
另外，在血液储存部10的主体部11的上边缘端的接口处气密性地连接有2根管41、42。其中的管41为了起到用于导入血液的导入路的作用，在另一端上连接有采血针30或能够与采血针连接的连接部。通过成为这种结构，可以在不使采集的血液与外界气体相接触的情况下调制成血清。
气密性地连接于血液储存部10的另一个管42介由管43～46、51～56和分支体61～65而连接于各袋体21～26。它们起到用于导出分离的血液成分的导出路的作用。这些管41～46、51～56由具有柔软性的树脂材料、例如软质聚氯乙烯等材料构成。这里，对于成分收纳部20的袋体21～26和各管51～56而言，也是通过溶剂粘合、热熔融粘合或超声波熔融粘合等而气密性地连接。
<血清调制工序>
使用图2和图3说明使用了具有上述构成的血清调制装置1的血清调制工序。
如图2所示，使用了上述血清调制装置1的血液分离操作大致分为7个工序(S1～S7)。
首先，作为操作的第1阶段，将上述图1的采血针30刺入到对象者(患者)中采集血液。此时，由采血针30采集的血液经由管41而储存在位于下方的血液储存部10中(储存工序S1)。这里，为了使采集到血液储存部10中的血液不流入到成分收纳部20中，使用夹子等在血液储存部10的根基侧将通路封闭。储存工序S1考虑采血时患者的身体状态等而采集所需量后结束。这里所谓的所需量在患者的体格、身体状态没有问题时是指200(ml)～600(ml)左右。
接着，如图2所示，开始储存工序S1后，与其同时进行血液储存部10的振荡(活化促进工序S2)。如图3所示，通过振荡装置100缓慢地搅拌储存有所采集血液的血液储存部10，从而与收纳在内部的玻璃加工体12相接触。这样，血液中所含的血小板和凝固因子在玻璃加工体12的表面上凝固，从凝固时被活化的血小板中释放来自于其中的生长因子(如果在低温下进行该活化促进工序，则对于血小板的凝集促进是有效的)。储存工序S1后，从采血对象者上拔出采血针30，将连接采血针30和血液储存部10的管41的一部分熔断，且同时将其熔断端熔融粘合(熔断工序S3)。
另一方面，从对象者分离的血液储存部10与成分收纳部20、连接它们之间的各管42～46、51～56、分支体61～65等一起经过活化促进工序S2，汇集至小盒子中，安装于离心分离机上(离心分离工序S4)。对血液储存部10的离心分离条件根据所储存的血液的量和分离成分的种类而设定，例如设定为2,250(g)×10(min.)、4(℃)。需要说明的是，此时，管42通过与储存工序S1时同样能够破裂的隔壁或夹子而保持在通路被封闭的状态。
熔断工序S3和离心分离工序S4在预先添加抗凝固剂后进行采血时可以在活化促进工序S2之前进行。此时，离心分离条件优选如下。
全血的离心分离4,400(g)×4～6(min.)、2,250(g)×10(min.)多血小板血浆(PRP)的离心分离1,100g×4～6(min.)返回到图2，以从活化促进工序S2利用离心分离工序S4活化的血球成分为起始的被活化因子成为块状而从血液中分离(分离工序S5)。另外，在分离工序S5中，在血液储存部10内分离提取的血清71通过对血液储存部10进行加压，按顺序地分装到各袋体21～26的所有或一部分中(导出工序S6)。
返回到图2，在袋体21中填充所需量的血清后，将管51熔断并熔融粘合(熔断工序S7)。对于该熔断和熔融粘合，使用在离心分离工序S4之前将管42熔断并熔融粘合相同的方法来实施。另外，对于在内部填充有血清的袋体21，例如实施冷冻保存等保存处置。
分别对各个袋体21～26依次实施该导出工序S6和熔断工序S7，在血清填充到全部或一部分袋体21～26中时，结束血清调制操作。另外，还可以根据需要利用生理盐水、CPD液、ACD-A液等抗凝固剂或MAP液等血液保存液来洗涤稀释红血球，从而作为输血用血液来保存。
实施例以下更加详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
<实施例1>
在装有5个玻璃珠(Φ4mm、50mm2)的容器中加入新鲜的人血液20(ml)，通过多功能振荡器(MMS-300，东京理科器械生产)振荡。在开始振荡10、20、30、60分钟后将血液(1ml)采集到加有抗凝固剂的采样管中，通过离心分离将血清分离。另外，从同一对象者采集加有CPD的血液，分离血浆。在分离的血浆中添加氯化钙，在37℃下使纤维蛋白析出，调制血清。对于通过装有玻璃珠的容器调制的血清和通过从加有CPD的血液中分离出的血浆调制的血清，测定生长因子(PDGF-BB、TGF-β1)。结果示于表1中。需要说明的是，生长因子的测定是使用R&D SYSTEMS公司生产的测试试剂盒和酶标仪(MultiskanBICHOROMATIC Labsystem公司生产)来实施的。
表1 由血清来源的不同导致的生长因子含量的不同
对于通过配置有5个玻璃珠的容器所调制的血清而言，PDGF-BB的含量随着振荡时间的增加而上升，在60分钟后，每1(ml)血清释放1677.2(pg)。此时，同一对象者的血浆来源血清中所含有的PDGF-BB量为小于检测限的32.5(pg/ml)。对于TGF-β1，在通过配置有5个玻璃珠的容器调制的血清中，在开始振荡10分钟时每1(ml)血清已经释放了21.2(ng)的TGF-β1，之后随着时间的延长，释放量缓缓增加，在60分钟后达到29.6(ng/ml)。另一方面，同一对象者的血浆来源血清的TGF-β1的释放量为每1(ml)血清1.5(ng)。
<实施例2>
准备不含玻璃珠的采血容器(试样3)、装有5个玻璃珠的采血容器(试样1)和装有20个聚乙烯颗粒的采血容器(试样2)的共计3种容器。在各容器中分别加入20(ml)来自于同一对象者的新鲜血液，通过多功能振荡器(MMS-300，东京理科器械生产)振荡。在开始振荡10、20、30、60分钟后将血液(1ml)采集到加有抗凝固剂的采样管中，使用血球计数装置(多项目自动血球计数装置K-4500，シスメツクス生产)计算血小板的数量。
另外，将各试样离心分离，分离血清，测定血清中的生长因子(PDGF-BB、TGF-β1)。生长因子的测定是使用R&D SYSTEMS公司生产的测试试剂盒和酶标仪(Multiskan BICHOROMATIC Labsystem公司生产)来实施的。
另外，从同一对象者身上采集血液至市售的临床检查用真空采血管(ベノジエクトII，テルモ公司生产)中，在室温下放置1小时后，分离血清，同样进行生长因子的定量。对于血小板数，将刚采血后的值为100％时的值作为血小板残存率。对于各生长因子，将使用该真空采血管调制的血清中的生长因子量规定为血小板中的生长因子的潜在量，将在各振荡时间获得的血清中的生长因子量与上述潜在量之比表示为释放率。
图4为表示振荡时间和各试样中的血小板残存率的图。振荡开始后20分钟以内试样1中的血小板残存率降低至约2％左右。另一方面，试样2比试样1稍晚，在开始振荡后的30分钟以内减少。另外，试样3在开始振荡后就急剧地减少，但在开始振荡后60分钟时血小板残存率勉强减少至2％以下。
图5为表示振荡时间和各试样中的PDGF-BB的释放率的关系的图。试样1在振荡开始后PDGF-BB随着时间急剧地释放，在振荡1小时后，释放了血清中的潜在量的约90％。剩下的2个试样中，虽然血小板数减少，但PDGF-BB的释放量连血清中潜在量的20％也没有释放。
图6表示振荡时间和各试样中的TGF-β1的释放率的关系的图。试样1的血清中从开始振荡10分钟后释放了血清中潜在量的近70％量的TGF-β1。在剩下的2个试样中，也可看到其释放量增加的倾向，但即便在60分钟后，其释放率也停留在血清中的潜在量的40％左右。以上结果表明，为了除去血液中的血小板，聚乙烯颗粒虽然也起到了与玻璃珠相同的作用，但不能活化血小板。
权利要求
1.一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，其中，采血后的20分钟以内的血小板残存率超过总血小板量的0％但为20％以下，且细胞生长因子的释放率为20％～100％。
2.一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，其中，所述细胞生长因子的含量比由血浆调制的人血清更多。
3.一种细胞培养用人血清，其由包含含有血液凝固因子的血液来源的液体成分和血小板的流体获得，其中，所述细胞生长因子的含量比通过放置调制的人血清更多。
4.权利要求1～3任一项所述的细胞培养用人血清，其中，所述细胞生长因子含有PDGF-BB或TGF-β1中的至少任意一种。
5.权利要求1～4任一项所述的细胞培养用人血清，其中，所述细胞生长因子是通过使所述流体与玻璃加工体相接触而获得的。
6.权利要求5所述的细胞培养用人血清，其中，所述玻璃加工体为玻璃珠。
7.权利要求1～6任一项所述的细胞培养用人血清，其中，在不与外界气体接触的情况下来进行调制。
8.权利要求1～7任一项所述的细胞培养用人血清，其用于再生医疗方法中。
全文摘要
本发明提供大量含有能够高效地促进干细胞增殖的生长因子的血清。其中使用采血后的20分钟以内的血小板残存率为总血小板量的20％以下、且细胞生长因子的释放率为20％以上的细胞培养用人血清。
文档编号G01N33/48GK101061218SQ20058003921
公开日2007年10月24日 申请日期2005年11月2日 优先权日2004年11月19日
发明者铃木康二, 田中圣真 申请人:株式会社Jms