角膜模型低温保存用固体培养基及制备方法和使用方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种角膜模型低温保存用固体培养基及制备方法和使用方法。

背景技术：

随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3d重组角膜上皮模型，在眼刺激风险评价领域表现出特有的趋势。体外构建的3d角膜上皮模型类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，除了不同功效目的的剂型开发，也包括化妆品具体成分的危害评价。经济合作与发展组织（oecd）已通过角膜模型epiocular的验证和相应的测试法案。

由于体外3d角膜模型的自身特点，要求能够在体外保持其结构和活性，从而确保测试结果的准确性，因此模型的应用受到其保存运输条件的制约，同时还应最大限度地排除外来化学物的影响。因此开发一种适合体外重建3d角膜模型保存运输的培养基意义重大。

目前临床上角膜保存方法多样，包括短期保存、中期保存、中长期保存、长期保存、非活性保存等。其中，短期保存法即湿房保存，是将全眼球消毒处理后在湿房内4℃保存，仍是许多眼库运用最多的角膜短期保存方法。优点是简便、经济，但受保存时间限制，一般只能保存24~48h。中期保存液保存是用活性保存液4℃低温条件下使角膜活性保持4~14d，以至更长时间的方法。1973年美国mccary和kaufman发明了第一代角膜保存液，即mk液，开创了角膜中期保存的先河。其方法简单、经济，效果可靠，但保存时间有限，一般认为4d以内效果最佳。随后许多学者在mk液基础上进行改进，加入硫酸软骨素和hepes缓冲系统，经过改进，角膜保存液可有效保存10~14d，其代表是k-sol，csm，dexsol液。1990年kaufman和lindstrom研制出新一代optisol角膜中期保存液，是目前公认的较理想的保存液。中长期保存即器官培养是用模拟角膜生理环境的组织培养液，在近似角膜生理温度条件下30~37℃提供角膜必需的营养和条件来保存角膜，能较好地维持角膜的代谢，有利于角膜创伤修复，确保活性达4~5周。使用器官培养液的一个缺点是保存期间角膜水肿，因此必须在角膜移植术前使角膜脱水，而角膜水肿和脱水过程中可导致角膜内皮细胞损伤。但该方法需要在30~37℃环境中经常更换培养液，容易造成污染而致保存失败，且对设备及检测技术要求较高、操作复杂，目前在我国难以推广。长期保存即深低温保存是将角膜在冷冻剂保护下，控速降温到-80℃，然后贮存于-196℃液氮中，待用时复温取出，可保存1年以上。深低温下可完全抑制细胞的能量代谢，使之呈“休眠状态”，从而避免因代谢产物积聚的毒害及代谢所需的营养物质缺乏而死亡，另外还可避免微生物繁殖而使角膜受染。由于深低温保存的角膜期限长、细胞活性接近新鲜角膜，用于穿透角膜移植术后透明率与新鲜角膜相仿且能随时提供移植材料，是眼库长期保存角膜的理想方法之一。但降温操作复杂，如有不慎容易引起细胞冰晶损害，如角膜内皮产生裂孔、细胞间连接断裂、角膜内皮大片坏死和结构改变，使细胞在复温培养过程中死亡。对冷冻保护剂研究发现，二甲亚砜、丙二醇、硫酸软骨素均能使角膜细胞获得玻璃化作用，减少冰晶的发生，但必须采用稳定的方法使角膜细胞和冷冻保护剂达到平衡。非活性保存是一种防腐保存，分为干燥保存、冷冻保存等，是通过对角膜加工处理，使角膜组织内移去水分，阻止细胞酶失活，抑制组织细胞自溶，从而保持组织细胞的完整性。多数学者认为非活性保存材料只能用于板层角膜移植，因为板层角膜移植所需要的材料不要求内皮细胞具有活性，只要具有完整胶原板层结构就能使用，植片移植后只能充当一个支架组织。

但是，目前保存液多用于临床移植角膜的保存，而在临床移植中，内皮细胞的活性对移植成功率具有较大影响。因此，目前角膜保存的关键在于最大程度地维持内皮细胞活性，抑制基质水肿，维持角膜正常厚度，从而维持手术后角膜的透明性。这也是目前角膜保存液的研究重点。也有学者发现，上皮的完整对角膜移植术后植片的存活很重要，上皮缺乏会延缓伤口愈合，植片感染，间质斑痕化，促进新生血管生长和非特异性炎症反应，诱导排斥反应的发生，最终手术失败。但目前角膜保存方法中很少关注到这一点。

目前常见的体外模型保存方法有低温保存和常温保存两种，低温保存又可分为低温冷藏保存（4℃~8℃）和低温冷冻保存（-80℃和-196℃）。而低温冷冻过程中易产生冰晶，会对细胞、组织造成损伤，并且低温冷冻保护剂浓度过高会给模型带来毒性作用，影响产品应用效果，另外，该方法操作复杂，需要专业人员，设备昂贵，难于推广。体外构建3d模型一般采用4℃~8℃低温冷藏保存。然而，在4℃～8℃的低温条件下，尤其是在一个相对缺氧的无菌保存条件下，由于能量供给系统平衡被打破，导致角膜模型中的细胞内外离子泵功能受阻，引起细胞内外na+/k+比及ca2+浓度失衡，细胞内部依赖该类离子的酶及生化反应过程受到影响，导致细胞生理活动受阻，细胞膜及细胞骨架损伤，表现为细胞肿胀、坏死或凋亡；另外，随着保存时间的加长，细胞也由有氧代谢途径转为无氧代谢途径，从而会产生大量的自由基和酸，自由基会选择性攻击细胞膜系统，加剧细胞低温损伤，最终造成皮肤模型失去活性。

中国专利200910078302.x中提到在基础培养液中加入营养物质和琼脂，制成固体培养基，用来保存组织工程皮肤，但该培养基仅限于常温保存，因地域、季节等多种因素，要维持常温保存条件需要特殊的温控设备，从而大幅度增加运输成本；若将该培养基用于低温保存运输，在长期低温缺氧状态下，细胞能量利用途径发生改变，由原来的有氧呼吸转为糖酵解，能量利用率大幅度降低，需要及时补充糖酵解所需代谢底物。同时需要补充能够提高各种生物酶活性的物质，对于糖酵解产生的大量的酸和自由基也应有抗氧化剂予以清除，而该培养基从成分上看仅包含能维持组织工程皮肤正常生理活动的物质，不具备能满足能量代谢转换，抑制代谢产物等损伤的成分，因而不具备有效减低低温缺氧损伤的作用，后果是细胞因为缺氧损伤及氧化损伤得不到抑制而导致整个组织活力下降，组织结构破坏，无法进行后续操作。

至今尚没有一种较理想的角膜模型的低温保存运输培养基，该培养基应具有减少组织细胞低温缺氧损伤，有效保证角膜模型测试结果的准确性，同时方便操作及长途运输的特点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种角膜模型低温保存用固体培养基。该培养基具有减少组织细胞低温缺氧损伤的优点，能够有效保证角膜模型测试结果的准确性，同时方便操作及长途运输。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种角膜模型低温保存用固体培养基，其特征在于，所述固体培养基由基础培养基和琼脂糖水溶液按照1:1的体积比混合均匀后凝固制成；所述琼脂糖水溶液的质量浓度为0.5%～5%；所述基础培养基以dmem培养液和f12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸、谷氨酰胺和低温保护剂；所述dmem培养液和f12培养液的混合溶液中dmem培养液和f12培养液的体积比为3:（1～9），所述基础培养基中胎牛血清的体积百分含量为5%～20%，维甲酸的浓度为4μg/ml～10μg/ml，人表皮生长因子的浓度为0.1ng/ml～10.0ng/ml，胰岛素的浓度为5.0ng/ml～50.0ng/ml，氢化可的松的浓度为0.1μg/ml～10.0μg/ml，腺嘌呤的浓度为5.0μg/ml～50.0μg/ml，三碘甲状腺氨酸的浓度为0.1μg/ml～10.0μg/ml，谷氨酰胺的浓度为0.2g/l～20.0g/l；所述低温保护剂为hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素的混合物，基础培养基中hepes的浓度为1mmol/l～100mmol/l，蔗糖的浓度为0.1mmol/l～50mmol/l，甘氨酸的浓度为0.1mmol/l～100mmol/l，丙氨酸的浓度为0.1mmol/l～100mmol/l，腺苷的浓度为1mmol/l～200mmol/l，维生素e的浓度为0.01mmol/l～20mmol/l，维生素c的浓度为0.01mmol/l～20mmol/l，透明质酸的体积百分含量为0.1%～10%，硫酸软骨素的浓度为1g/l～100g/l。

上述的角膜模型低温保存用固体培养基，其特征在于，所述琼脂糖为低熔点琼脂糖，低熔点琼脂糖的成胶温度为28℃～32℃，熔化温度为62℃～68℃。

另外，本发明还提供了一种制备上述角膜模型低温保存用固体培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将dmem培养液和f12培养液混合均匀，然后加入胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸和谷氨酰胺，溶解后过滤除菌，得到角膜模型培养基；

步骤二、向步骤一中所述角膜模型培养基中加入hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素，溶解后过滤除菌，得到基础培养基；

步骤三、将琼脂糖用去离子水溶解后灭菌，得到琼脂糖水溶液；

步骤四、将步骤三中所述琼脂糖水溶液缓慢加入步骤二中所述基础培养基中，震荡混合均匀后加入孔板中，凝固后得到角膜模型低温保存用固体培养基。

进一步的，本发明还提供了一种上述角膜模型低温保存用固体培养基的使用方法，其特征在于，所述使用方法为：将培养完成的角膜模型连同外部培养小室嵌入固体培养基中，然后一同置于无菌袋中封口，4℃条件下保存；保存结束后用37℃预热的角膜模型培养基对角膜模型进行复苏。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的培养基中含有胎牛血清，胎牛血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，能够提供人工合成培养液中所缺少的生物因子及物理因素，形成与体内微环境相似的细胞生长场所，使细胞生长或抑制达到生理平衡。除此之外，还含有各种因子，调节细胞的活性。其中维甲酸能够促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。人表皮生长因子能够刺激细胞生长迁移，抑制衰老基因的出现，延缓上皮细胞衰老。胰岛素可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成rna、蛋白质和脂质，胰岛素还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用。氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖作用，细胞密度高时可诱导细胞发生分化。腺嘌呤是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成，提供细胞增殖分化所需的atp，抑制细胞凋亡。三碘甲状腺氨酸可促进细胞增殖，抑制其凋亡。

2、本发明优选的低温保护剂为hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素，这些因子具有调节细胞离子转运、稳定细胞膜系统及细胞骨架，清除自由基，提高细胞能量代谢率等作用，可保护细胞、组织免受低温损伤。其中hepes提供维持细胞活性所需的ph范围。蔗糖主要对维持细胞内外液体渗透压有重要作用。甘氨酸、丙氨酸具有对受损细胞的修复作用，可以有效的减少细胞及组织在低温缺氧状态下的损伤。腺苷可以维持组织在有氧代谢及无氧代谢条件下的能量供应，保证细胞正常生理活动需要。维生素e属于抗氧化剂。而维生素c和维生素e协同作用可以更有效的发挥维生素e的抗氧化作用，降低自由基对细胞的损伤作用。透明质酸是葡糖醛酸和n-乙酞氨基葡萄糖为双糖单位构成的直链高分子多糖，含有大量的羧基和羟基可与水形成氢键而结合大量的水，能进行溶液渗透压的调节；并且对细胞具有多种保护作用，对带电大分子的扩散具有阻止作用，对细胞行为也具有一定影响；透明质酸还能抑制自由基的形成与释放。硫酸软骨素作为抗氧化剂，在细胞的氧化还原系统中具有重要作用，并且是良好的膜稳定剂和生长因子稳定剂。

3、本发明的固体培养基具有减少组织细胞低温缺氧损伤的优点，能够有效保证角膜模型测试结果的准确性，同时方便操作及长途运输。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为采用常规方法培养的角膜模型的组织学切片he染色照片。

图2为采用常规方法培养的角膜模型经实施例1的固体培养基保存24h后的组织学切片he染色照片。

具体实施方式

实施例1

本实施例的角膜模型低温保存用固体培养基，所述固体培养基由基础培养基和琼脂糖水溶液按照1:1的体积比混合均匀后凝固制成；所述琼脂糖水溶液的质量浓度为0.5%，琼脂糖为低熔点琼脂糖，低熔点琼脂糖的成胶温度为28℃，熔化温度为62℃；所述基础培养基以dmem培养液和f12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸、谷氨酰胺和低温保护剂；所述dmem培养液和f12培养液的混合溶液中dmem培养液和f12培养液的体积比为3:1，所述基础培养基中胎牛血清的体积百分含量为5%，维甲酸的浓度为4μg/ml，人表皮生长因子的浓度为0.1ng/ml，胰岛素的浓度为5.0ng/ml，氢化可的松的浓度为0.5μg/ml，腺嘌呤的浓度为25.0μg/ml，三碘甲状腺氨酸的浓度为0.1μg/ml，谷氨酰胺的浓度为0.2g/l；所述低温保护剂为hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素的混合物，基础培养基中hepes的浓度为2mmol/l，蔗糖的浓度为0.5mmol/l，甘氨酸的浓度为5mmol/l，丙氨酸的浓度为5mmol/l，腺苷的浓度为25mmol/l，维生素e的浓度为0.05mmol/l，维生素c的浓度为0.1mmol/l，透明质酸的体积百分含量为0.1%，硫酸软骨素的浓度为1g/l。

本实施例的固体培养基的制备方法包括以下步骤：

步骤一、将dmem培养液和f12培养液混合均匀，然后加入胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸和谷氨酰胺，溶解后过滤除菌，得到角膜模型培养基；

步骤二、向步骤一中所述角膜模型培养基中加入hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素，溶解后过滤除菌，得到基础培养基；

步骤三、将低熔点琼脂糖用去离子水溶解后灭菌，得到琼脂糖水溶液；

步骤四、将步骤三中所述琼脂糖水溶液缓慢加入步骤二中所述基础培养基中，震荡混合均匀后加入12孔板中，凝固后得到角膜模型低温保存用固体培养基。

本实施例的固体培养基的使用方法为：将常规方法培养完成的角膜模型连同外部培养小室嵌入固体培养基中，然后一同置于无菌袋中封口，4℃条件下保存24h；保存结束后用37℃预热的角膜模型培养基对角膜模型进行复苏，在37℃、5%co2孵箱培养复苏24h，即可用于后续检测项目。

图1为采用常规方法培养的角膜模型的组织学切片he染色照片。图2为采用常规方法培养的角膜模型经本实施例的固体培养基保存24h后的组织学切片he染色照片。对比图1和图2可以看出，采用本实施例的固体培养基保存运输后，角膜模型的复层化结构依然完整，细胞凋亡现象较少。说明本实施例的固体培养基和保存方法具有维持模型结构及活性的能力。

实施例2

本实施例的角膜模型低温保存用固体培养基，所述固体培养基由基础培养基和琼脂糖水溶液按照1:1的体积比混合均匀后凝固制成；所述琼脂糖水溶液的质量浓度为1.0%，琼脂糖为低熔点琼脂糖，低熔点琼脂糖的成胶温度为32℃，熔化温度为68℃；所述基础培养基以dmem培养液和f12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸、谷氨酰胺和低温保护剂；所述dmem培养液和f12培养液的混合溶液中dmem培养液和f12培养液的体积比为1:1，所述基础培养基中胎牛血清的体积百分含量为20%，维甲酸的浓度为10μg/ml，人表皮生长因子的浓度为1.0ng/ml，胰岛素的浓度为20.0ng/ml，氢化可的松的浓度为0.2μg/ml，腺嘌呤的浓度为50.0μg/ml，三碘甲状腺氨酸的浓度为0.1μg/ml，谷氨酰胺的浓度为0.2g/l；所述低温保护剂为hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素的混合物，基础培养基中hepes的浓度为5mmol/l，蔗糖的浓度为1.0mmol/l，甘氨酸的浓度为5mmol/l，丙氨酸的浓度为5mmol/l，腺苷的浓度为50mmol/l，维生素e的浓度为0.2mmol/l，维生素c的浓度为1mmol/l，透明质酸的体积百分含量为0.5%，硫酸软骨素的浓度为25g/l。

本实施例的固体培养基的制备方法包括以下步骤：

步骤一、将dmem培养液和f12培养液混合均匀，然后加入胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸和谷氨酰胺，溶解后过滤除菌，得到角膜模型培养基；

步骤二、向步骤一中所述角膜模型培养基中加入hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素，溶解后过滤除菌，得到基础培养基；

步骤三、将低熔点琼脂糖用去离子水溶解后灭菌，得到琼脂糖水溶液；

步骤四、将步骤三中所述琼脂糖水溶液缓慢加入步骤二中所述基础培养基中，震荡混合均匀后加入24孔板中，凝固后得到角膜模型低温保存用固体培养基。

本实施例的固体培养基的使用方法为：将常规方法培养完成的角膜模型连同外部培养小室嵌入固体培养基中，然后一同置于无菌袋中封口，4℃条件下保存24h；保存结束后用37℃预热的角膜模型培养基对角膜模型进行复苏，在37℃、5%co2孵箱培养复苏18h，即可用于后续检测项目。

对本实施例保存后的角膜模型进行组织学切片he染色，结果显示，采用本实施例的固体培养基保存运输后，角膜模型的复层化结构依然完整，细胞凋亡现象较少。说明本实施例的固体培养基和保存方法具有维持模型结构及活性的能力。

实施例3

本实施例的角膜模型低温保存用固体培养基，所述固体培养基由基础培养基和琼脂糖水溶液按照1:1的体积比混合均匀后凝固制成；所述琼脂糖水溶液的质量浓度为5%，琼脂糖为低熔点琼脂糖，低熔点琼脂糖的成胶温度为30℃，熔化温度为65℃；所述基础培养基以dmem培养液和f12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸、谷氨酰胺和低温保护剂；所述dmem培养液和f12培养液的混合溶液中dmem培养液和f12培养液的体积比为1:3，所述基础培养基中胎牛血清的体积百分含量为10%，维甲酸的浓度为4μg/ml，人表皮生长因子的浓度为0.5ng/ml，胰岛素的浓度为10.0ng/ml，氢化可的松的浓度为1.0μg/ml，腺嘌呤的浓度为50.0μg/ml，三碘甲状腺氨酸的浓度为0.2μg/ml，谷氨酰胺的浓度为0.2g/l；所述低温保护剂为hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素的混合物，基础培养基中hepes的浓度为10mmol/l，蔗糖的浓度为2.0mmol/l，甘氨酸的浓度为2mmol/l，丙氨酸的浓度为2mmol/l，腺苷的浓度为50mmol/l，维生素e的浓度为0.2mmol/l，维生素c的浓度为1mmol/l，透明质酸的体积百分含量为0.5%，硫酸软骨素的浓度为25g/l。

本实施例的固体培养基的制备方法包括以下步骤：

步骤一、将dmem培养液和f12培养液混合均匀，然后加入胎牛血清、维甲酸、人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、三碘甲状腺氨酸和谷氨酰胺，溶解后过滤除菌，得到角膜模型培养基；

步骤二、向步骤一中所述角膜模型培养基中加入hepes、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素e、维生素c、透明质酸和硫酸软骨素，溶解后过滤除菌，得到基础培养基；

步骤三、将低熔点琼脂糖用去离子水溶解后灭菌，得到琼脂糖水溶液；

步骤四、将步骤三中所述琼脂糖水溶液缓慢加入步骤二中所述基础培养基中，震荡混合均匀后加入6孔板中，凝固后得到角膜模型低温保存用固体培养基。

本实施例的固体培养基的使用方法为：将常规方法培养完成的角膜模型连同外部培养小室嵌入固体培养基中，然后一同置于无菌袋中封口，4℃条件下保存72h；保存结束后用37℃预热的角膜模型培养基对角膜模型进行复苏，在37℃、5%co2孵箱培养复苏18h，即可用于后续检测项目。

对本实施例保存后的角膜模型进行组织学切片he染色，结果显示，采用本实施例的固体培养基保存运输后，角膜模型的复层化结构依然完整，细胞凋亡现象较少。说明本实施例的固体培养基和保存方法具有维持模型结构及活性的能力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。