一种可提高细胞扩增速度的培养瓶的制作方法
【专利摘要】一种能够提高细胞扩增速度的培养瓶。其透气的底部被脊状隔离分隔成多个小格，能降低悬浮生长的细胞在培养过程中的漂浮移动，避免细胞聚集形成过大的细胞团，从而保证细胞团内部的细胞不会因为氧气和营养物质不足而导致生长缓慢。该培养瓶特别适合易聚集成团的免疫细胞的体外培养。
【专利说明】一种可提高细胞扩増速度的培养瓶
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于细胞培养领域，尤其是免疫细胞体外扩增的培养容器。
【背景技术】
[0003]细胞培养是生物及医疗工程领域很重要的一项技术。目前常用的细胞体外扩增容器有多孔板、T型培养瓶、透气的培养袋、底部透气的培养瓶，以及大型的发酵罐。在研发的最初阶段，多孔板和T型培养瓶是最常用的，这是因为细胞在这两类容器里生长良好且方便在显微镜下观察细胞形态。这两类的容器很适合小规模的细胞培养，但对于近年来兴起的个体化的癌症细胞免疫疗法所需的数十亿级细胞量的中等规模培养，它们就不合适了。多孔板需要打开盖子操作，很容易被微生物污染，而且处理各个孔所需的工作量都使得多孔板不适合用于大规模的细胞培养。T75或T175培养瓶里的细胞都沉在不透气的瓶底，气体交换受限于培养液的深度，导致瓶里液面上的空间无法利用，白白占用了培养箱的空间。透气的培养袋节克服了T型培养瓶的上述缺点，但培养袋不方便换液，容易被刮破。有鉴于此，人们又发明了底部透气的培养瓶，比如Wilson Wolf Manufacturing所开发的G-Rex，它换液方便，操作简单，没有气体交换受限的问题，大大简化了中等规模细胞培养的过程(US 8，158,426 B2)。
[0004]虽然透气的培养瓶操作简单，很适合中等规模的细胞培养，但免疫细胞在其中的一周内的扩增倍数却只有24孔板的1/2至2/3。为什么免疫细胞在透气的培养瓶生长不如24孔板?仔细观察细胞在两种情况下的状态就会发现，虽然在培养2天后细胞都以聚集成团的形态生长，但在24孔板里只形成直径不到I毫米的小团，而在透气的培养瓶里所形成的细胞团的直径会大至4毫米。这表明很有可能是因为这些细胞团太大了以至影响到氧气和营养物扩散到细胞团的中心。
[0005]但是简单地用移液管打散这些大细胞团并不能解决问题:第二天细胞又重新聚集成大细胞团。这现象和使用的透气材料有关:为了良好的透气，透气的培养瓶底部用的是透气率最佳的娃胶薄膜(AvgoustiniatosES，Hering BJ, etal.Transplantat1nProceedings，2008，40: 395-400)。硅胶是疏水性的，细胞很难附着在其上，在培养箱里，机器运行时各种轻微的振动，以及开关培养箱的动作，都会导致细胞随培养液浮动而进一步聚集成大团。
[0006]为了防止细胞聚集成大细胞团，必须降低细胞的飘浮移动。一种方法是通过处理硅胶膜表面，使其利于细胞附着而减少细胞飘浮，但即便用电弧等离子处理硅胶表面，也只能暂时使其具有亲水性，内部的硅胶寡聚物很快会通过扩散迀移至表面，使硅胶表面恢复疏水特性，无法让细胞附着(Everaert EP, VandermeiHC,et al.J AdhesSciTechnol，1996,10:351-359.)。因此迫切需要另辟蹊径开发出新的培养容器以解决这问题。
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【发明内容】
[0008]本发明描述了一种降低因细胞在培养瓶底部飘浮移动而形成过大细胞团的方法和新型培养瓶。通过将培养瓶底部的大片平坦区域以脊状隔离分隔成多个面积较小的格子，可有效降低细胞漂浮移动，避免细胞聚集成过大的细胞团，从而保证在形成的小细胞团内部的细胞能得到充分的氧气及养份供应，达到快速增值的目的。
[0009]新本发明所述的新型培养瓶底部所分隔成格子的大小和细胞增值率密切相关。当格子大小在11平方厘米以下时，所形成的细胞团直径小于2毫米，细胞扩增倍数都保持着和使用24孔板类似的水平;但格子大扩大至25平方厘米时，脊状隔离已无法有效降低细胞的漂浮移动，导致直径大于4毫米的大细胞团的形成，细胞的扩增率也随之降低。
[0010]本发明所述的培养瓶底部材料可采用透气薄膜如硅胶薄膜以保证培养瓶内外的气体交换。脊状隔离可用各种材料如塑料或硅胶制成，不宜过宽，以免占用过多底部的透气面积。脊状隔离的高度2-4毫米，过低无法有效阻止细胞的漂浮移动，过高则会在摇动培养瓶混匀内容物时影响液体流动，导致细胞、培养基及细胞因子混合不均。
[0011]本发明的有益效果:底部被分隔成小格的培养瓶继承了现有的底部透气培养瓶操作简单的优点，比起多孔板，在添加细胞或培养液，以及收获细胞方面都更方便，因不需要对每个孔都重复一样的操作，提高了效率，降低了污染几率。同时该新型培养瓶还克服了用现有的底部透气培养瓶培养细胞，特别是易聚集成团的免疫细胞增殖率低下的问题，达到了和使用24孔板一样的高增殖倍数。
[0012]
【附图说明】
[0013]图1是底部分隔成小格的培养瓶剖视(A)和俯视(B)图。图中1.培养瓶壁，2.细胞小团，3.透气薄膜，4.脊状隔离。
[0014]图2是用本发明的培养瓶培养EB病毒特异性T细胞在不同分隔大小下的扩增速度图。
[0015]图3是志愿者I的EB病毒特异性T细胞对B淋巴母细胞系的杀伤活力图。
[0016]图4是用本发明的培养瓶培养CIK细胞在不同分隔大小下的扩增速度图。
[0017]
【具体实施方式】
[0018]下面用实例具体说明本发明，但本发明并不以此为限。在下面的具体步骤里未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件，或制造厂商所建议的条件进行。
[0019]—、底部分隔成小格的培养瓶的制作。
[0020](I)先将0.1毫米厚的硅胶薄膜裁剪成为边长10厘米的正方形小片，再用尚未固化的硅胶在薄膜上做出类似图1的脊状隔离。隔离出的格子大小为2平方厘米(7X7)，4平方厘米(5X5)，11平方厘米(3X3)，25平方厘米(2X2)，以及100平方厘米(无隔离)。
[0021](2)将T150培养瓶的底部和瓶口对侧的多余部分切除，将上述带有隔离的硅胶薄膜用硅胶粘至切割好的T150培养瓶的底部，静置七天后硅胶固化完全，先用70%酒精清洗，再在紫外灯下灭菌30分钟后备用。
[0022]二、用新型培养瓶来培养EB病毒特异性T细胞。
[0023]本实验的目的是为了测试需要与滋养细胞共培养的免疫细胞在新型培养瓶里的增殖情况。
[0024](I)抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴细胞分离液Ficoll-Plaque Plus通过密度梯度离心分离出单个核细胞，用PBS洗涤2次后将所得的细胞冻存。
[0025](2)取I X 16的外周血单个核细胞用EB病毒感染，置于37°C，5%的⑶2培养箱里培养4周后，得到由B细胞转化来的B淋巴母细胞系。B淋巴母细胞系作为抗原呈递细胞，能在其细胞表面呈递EB病毒相关的抗原，当与外周血单个核细胞共培养时，其中EB病毒特异性的T细胞将被激活扩增，经过几轮的共培养后，扩增的细胞即为EBV特异性的T细胞。
[0026](3)将B淋巴母细胞以40 Gy的伽马射线辐照后，与外周血单个核细胞以1:40的比例置于24孔板里开始第一轮的共培养，12天后开始第二轮共培养，B淋巴母细胞与扩增后细胞的比例为1:4，同时培养基里加IL-2至终浓度为40 U/ml，在培养箱里培养7天。
[0027](4)按第二轮共培养的条件再进行2-3轮的共培养，直到所扩增的细胞数目达到5XlO8,所得的细胞即为EB病毒特异性的T细胞。
[0028](5)将EB病毒特异性的T细胞与辐照过的B淋巴母细胞置于上述新型培养瓶里共培养，每个培养瓶含I X 18的T细胞，2.5X 17的B淋巴母细胞，以及40 U/ml的几_2，培养3天后换新鲜的培养基，同时补充IL-2。
[0029](6)培养7天后收集所得的EB病毒特异性的T细胞，以台盼兰染色法在显微镜下检测并计算出所收获的总细胞数。取一部份所得的T细胞，以B淋巴母细胞作为靶细胞，测试其特异性杀伤活性。检测杀伤活性所用的试剂盒为PerkinElmer所产的DELFIA细胞毒性检测试剂盒。
[0030]EB病毒特异性T细胞在新型培养瓶里的增殖结果如图2所示，当培养瓶底部被分隔成多个小格后，细胞扩增倍数都比没分隔的要高。扩增倍数在每个分隔面积为11平方厘米后达到高点，再进一步减小所分隔的格子面积并不能进一步提高细胞扩增倍数。虽然细胞扩增的绝对倍数因血液来源差异有所不同，但这变化趋势在三位志愿者的血液样品上是一致的，培养瓶底部被分隔为不大于11平方厘米的小格后在7天内细胞扩增速度是底部面积为100平方厘米的1.8倍以上。
[0031]使用新型培养瓶后T细胞的扩增速度增加，但其对表达EB病毒特异性抗原的靶细胞杀伤活性并没改变。如图3所示，使用底部分隔大小不同的培养瓶，所培养出的T细胞对B淋巴母细胞的特异性杀伤活性在同一效靶比下是类似的，当效靶比在2:1至40:1时，特异性的裂解率都在40%至80%之间。
[0032]三、用新型培养瓶来培养CIK细胞本实验的目的是为了测试可单独培养的免疫细胞在新型培养瓶里的增殖情况。
[0033](I)抽取志愿者40毫升外周血，用淋巴细胞分离液Ficoll-Plaque Plus通过密度梯度离心分离出单个核细胞，将细胞置于含有I X 13 U/mlIFN-gamma的培养基里培养24小时。
[0034](2)于培养基里加入终浓度为100叫/1111的小鼠抗人003单抗、1\103 U/ml的IL-2以及I X 13 U/ml的IL-1alpha，继续培养，每隔3天换液，同时补充IL-2。
[0035](3)当CIK细胞总数到达5 X 18后，将细胞转移至上述新型培养瓶里培养，每个培养瓶含I X 18的T细胞，继续培养7天。
[0036](4)收集所得的CIK细胞，以台盼兰染色法在显微镜下检测并计算出所收获的总细胞数。
[0037]CIK细胞在新型培养瓶里的增殖结果如图4所示，与需要和B淋巴母细胞共培养的特异性T细胞的结果类似，当培养瓶底部被分隔成多个小格后，CIK细胞扩增倍数比没分隔的要高。扩增倍数在每个分隔面积为2至11平方厘米到达高点，在7天内细胞扩增速度是底部面积为100平方厘米的1.5倍以上。
[0038]以上这些结果证明了无论所培养的免疫细胞是需要与滋养细胞共培养的还是可单独培养的，使用本发明的新型培养瓶均能有效提高其扩增速度。
【主权项】
1.一种培养细胞的培养瓶，由底部和周围的壁构成一个可容纳培养基进行细胞培养的容器，其特征是:培养瓶底部被脊状隔1?分隔成多个小格。2.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征是:每个被分隔成的小格面积不大于11平方厘米。3.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征是:每个被分隔成的小格面积不大于4平方厘米。4.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征是:每个被分隔成的小格面积不大于2平方厘米。5.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征是:培养瓶底部的部份区域由透气薄膜构成。6.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征是:培养瓶底部的脊状隔离的高度不超过5毫米。
【文档编号】C12M1/24GK106085850SQ201610484994
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】罗益华, 吴春晓, 赵剑锋
【申请人】上海闪锦生物科技有限公司