一种扩增鱼类基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种扩增鱼类基因组DNA的方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 具有足量的高质量基因组DNA (genomic DNA, gDNA)是进行遗传研究，如疾病诊断、 基因分析等的基础。
[0003] 但在实际操作中，常因为可用的gDNA数量微少或质量不佳而成为研究分析的限 制性因素；这种状况在疾病诊断、肿瘤分子病理研究、法医遗传学等研究领域表现得尤为突 出。而从血液、毛发等痕量组织或培养的细胞系中获取gDNA费用较高、耗时较长。解决这些 问题的途径是对gDNA进行高质量的扩增，增加可利用的gDNA的数量。目前，已报道的gDNA 扩增方法主要包括兼并寡核苷酸引物PCR法（D0P-PCR)、扩增前引物延伸法（PEP)、连接反 应介导的基因组扩增法（LMP)和多重置换扩增法（MDA)。它们的主要原理为PCR扩增gDNA， 但均存在不同的优缺点。D0P-PCR法操作简单，但其扩增产物量少，扩增片段较小，且当初始 模板量较少时扩增不能覆盖整个基因组；PEP法使用了高度随机的引物，提高了gDNA扩增 覆盖率，对长期保存组织的扩增效果较好，但其扩增产量低，保真性差；MDA法扩增产量大， 可覆盖99. 98%的基因组序列，且保真性高，但其对初始模板质量要求较高；LMP法不能等 量扩增所有gDNA片段，且步骤较繁，扩增产物中引入了其他序列，丢失了酶切位点序列。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种扩增鱼类gDNA的方法，能克服现有技术 的缺点，实现鱼类gDNA快速、高质量的扩增，本发明耗时短、费用低，并且扩增效率、扩增质 量较高，在保证可靠性的情况下，本方法更简便、快捷。
【发明内容】
[0005] 为了克服【背景技术】中提到的问题，本发明提出一种扩增鱼类基因组DNA的方法， 首先提取鱼类基因组DNA作为模板，然后使用限制性内切酶酶切基因组DNA，产生的酶切 DNA片段连接特定的寡核苷酸接头，然后根据酶切位点序列与接头序列设计特定引物，并采 用PCR法扩增酶切片段，以此增加基因组DNA的数量。本发明能克服现有技术的缺点，实现 鱼类基因组DNA快速、高质量的扩增；本发明耗时短、费用低，并且扩增效率与扩增质量较 高，在保证可靠性的情况下，本方法更简便、快捷。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：
[0007] 所述的扩增鱼类基因组DNA的方法按照以下步骤进行：
[0008] 第一步、提取鱼类样品中的基因组DNA;
[0009] 第二步、使用限制性内切酶酶切鱼类的基因组DNA，限制性内切酶为：TaqI;
[0010] 第三步、酶切DNA片段连接特定的寡核苷酸接头，并根据酶切位点序列与接头序 列设计特定引物；酶切位点序列为：5' -AGCT-3';寡核苷酸接头为：adaptor-F:5' -GACG ATGAGTCCTGAG-3' ，adaptor-R:5' -CGCTCAGGACTCAT-3，；
[0011] 第四步、采用PCR法扩增酶切片段，以此增加鱼类的基因组DNA的数量；所述的 PCR 引物为：primer:5' -GATGAGTCCTGAGCGA-3'〇
[0012] 进一步，第一步具体步骤如下：
[0013] ①取一尾鱼类样品置于灭菌离心管中，待酒精挥发完毕后，加入400-600 iiL STE 裂解液，8-10 y L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，颠倒混匀，放置于55°C水浴或摇床上消化4h 以上；
[0014] ②消化至澄清后，向消化液中加入2-4yL浓度为4mg/mL的RNaseA，轻微颠倒混 匀，并放置于37°C水浴中消化0. 5-lh ;
[0015] ③加入等体积酚：氯仿1:1轻微颠倒混匀，12000rpm离心10-12min，小心打开离心 管并吸取上清液至另一个已灭菌离心管中；
[0016] ④加入2. 5倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒，并置于4°C环境中30-35min，之后低温 离心机中4°C下12000rpm离心10-12min，小心吸弃上清液保留沉淀；
[0017] ⑤加入200-300 y L浓度为75 %的乙醇洗涤沉淀，并于低温离心机中4 °C下 12000rpm离心10-12min，离心完毕后用移液器吸干离心管中的酒精；
[0018] ⑥自然风干10_15min，以无酒精挂壁为准，最后加入20-50 y L TE溶液溶解基因 组DNA，保存备用。
[0019] 进一步，第二步具体步骤如下：反应体系为15yL，包括200-250ng的50ng/yL样 品鱼基因组DNA，0.5yL浓度为10u/yL的TaqI限制性内切酶，3yL lOXTaqIbuffer， 超纯水6. 5 y L ;反应于65°C酶切3h以上，80°C变性20-30min ;酶切产物用1. 2%的琼脂糖 凝胶电泳检测。
[0020] 进一步，第三步具体步骤如下：使用T4连接酶将寡核苷酸接头连接在步骤二产生 的酶切片段的两端，具体步骤如下：连接反应体系为10 y L，包括6 y L第二步中的酶切产 物，lyL浓度为 lU/yL 的 T4连接酶，lyL 10XT4 131^€6^0.51^浓度为50^111〇1/1的 Taq I接头，超纯水1. 5 y L ;反应程序为16°C孵浴10h，结束后4°C保存。
[0021] 进一步，第四步具体步骤如下：采用PCR法扩增基因组DNA，PCR反应体系为 20 y L，包括第三步的1 y L连接产物，浓度为50 y mol/L的TaqIprimer 0. 15 y L，浓度为 5U/yL 的 Pfu DNA 聚合酶0.12yL，2yL 的 10XPCR Buffer，1.2yL浓度为 25nmol/yL 的MgCl2,0. 25 y L浓度为lOnmol/ y L的dNTP，加超纯水至总体积20 y L ;PCR反应程序为 95°C 5min，25 个循环包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] (1)酶切时使用高频限制性内切酶，产生较小的酶切片段，扩增时使用高保真的 Pfu DNA聚合酶，减小PCR过程中的扩增错误；
[0024] (2)在PCR扩增未进入平台期即停止扩增，减小PCR后期出现错配的可能；
[0025] (3)本发明建立的基因组扩增方法可解决大规模微卫星分子标记分析时DNA模板 数量不足的问题，本发明与FIASCO法（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing r印eats)采用相同的内切酶，即能够消除以扩增的基因组DNA做模板时由于微卫星位点被 内切酶酶切而导致微卫星标记扩增失败的情况。
【附图说明】
[0026]图1为技术方案步骤一中基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0027] 图2为技术方案步骤二中酶切的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0028] 图3为技术方案步骤四中扩增的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0029] 图4为稀释5000倍的基因组DNA原液、稀释1000倍的连接反应产物以及稀释50 倍的基因组扩增产物为模板，PCR扩增微卫星分子标记，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0030] 图5为使用扩增的鲫鱼基因组DNA为模板，微卫星分子标记的PCR产物的聚丙烯 酰胺凝胶电泳图；泳道1-48为48条鲫鱼初孵仔鱼的微卫星分子标记电泳图谱，泳道早、J 分别鲫鱼初孵仔鱼的父本与母本。
[0031] 图1中M泳道为DNAladder，1-10泳道为10个鲫鱼初孵仔鱼的基因组DNA;
[0032] 图2中M泳道为DNA ladder，1-4泳道为4个鲫鱼初孵仔鱼基因组DNA酶切电泳 图；
[0033] 图3中M泳道为DNA ladder，1-4泳道为扩增的4个鲫鱼初孵仔鱼基因组DNA的 电泳图；
[0034] 图 4 中 M 泳道为 DNA ladder，HLJYJ028(GenBank 登录号 FJ827516)与 HLJYJ055(GenBank登录号FJ827533)分别为鲫鱼的微卫星分子标记，A与D泳道为基因组 DNA稀释5000倍做模板，B与E泳道为连接产物稀释1000倍做模板，C与F泳道为基因组 DNA扩增产物稀释50倍做模板的微卫星分子标记PCR产物电泳图；以稀释5000倍的基因 组DNA原液、稀释1000倍的连接产物作为模板时均无法扩增微卫星分子标记，而以稀释50 倍的基因组DNA扩增产物作为模板时则能扩增出目的条带，说明基因组DNA扩增成功（由 于酶切-连接反应与本发明操作均使用了基因组DNA，它们分别稀释1000倍与50倍可使其 中的基因组DNA浓度与稀释5000倍的基因组DNA原液浓度一致，即含有等量的原始基因组 DNA)；
[0035] 图5中泳道1-48为48条鲫鱼初孵仔鱼的微卫星分子标记电泳图谱，泳道早、分 别鲫鱼初孵仔鱼的父本与母本。
【具体实施方式】
[0036] 下面将结合本发明实施例和附图1-5,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域一般技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 所述的扩增鱼类基因组DNA的方法按照以下步骤进行：
[0038] 第一步具体步骤如下：
[0039] ①取一尾鱼类样品置于灭菌离心管中，待酒精挥发完毕后，加入400-600 iiL STE 裂解液，8-10 y L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，颠倒混匀，放置于55°C水浴或摇床上消化4h 以上；
[0040] ②消化至澄清后，向消化液中加入2-4yL浓度为4mg/mL的RNaseA，轻微颠倒混 匀，并放置于37°C水浴中消化0. 5-lh ;
[0041] ③加入等体积酚：氯仿1:1轻微颠倒混匀，12000rpm离心10-12min，小心打开离心 管并吸取上清液至另一个已灭菌离心管中；
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