专利名称：一种分离鱼类反转座子SINEs的方法
一种分离鱼类反转座子SI NEs的方法技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及利用鱼类基因组内反转座子SINEs起源的特殊性、及其在基因组内的分布特点，选择特定的DNA序列设计独特的引物，运用分子克隆的方法，分离鱼类基因组内含有反转座子SINEs的目的片段。
背景技术：
反转座子SINE的基本结构一般由三部分组成5’端的头部、躯干部和尾部。头部为RNA相关区，衍生于相应的7SL RNA，tRNA或者5S rRNA ;躯干部来源不明，且长度也有变化；尾部为长度可变的具有简单重复序列区。在真核生物基因组中，SINE大约为IO3-1O5拷贝数，长度一般在100-600bp之间。SINEs通过RNA聚合酶III转录为RNA，经反转录酶作用形成的cDNA随机插入到基因组中，引起宿主基因组的突变，可作为一种有应用价值的分子标记，应用于物种鉴定和生物进化方面的研究。SINE的插入与特定的重组相关联，影响机体的应激反应和基因调控，同时，SINE插入的拷贝可成为宿主基因组的启动子、增强子，沉默子和功能基因的来源。已有研究表明，尽管属于同一家族的SINE，但其拷贝间的序列差异较大，最高可达35% ;不同科属的生物类群，具有特定的SINE ;这此特性为克隆生物基因组内的SINE带来了困难。
目前，较为有效的分离生物基因组内的SINE的方法6种l、pre-mRNA法。原理是利用SINE互补的pre-mRNA具有长发卡结构特点，首先获得发卡序列并用作探针，然后扫描基因组文库，找到SINE的全序列。2、基因组重复序列杂交法。利用SINE为大量拷贝而基因为单拷贝的特点，将标记的基因组DNA与基因组文库相杂交，去掉基因序列，找出重复序列的阳性克隆，然 后再多次杂交，测序，过滤基因序列，最终得到SINEs。3、体外转录法。以基因组DNA为模板，使用RNA聚合酶III进行体外转录，获得RNA并标记成探针，与基因组文库杂交，筛选阳性克隆，测序，获得SINE。4、A-B PCR法。以RNA聚合酶III的Box A和 Box B序列设计I对引物(A和B) ,A-B PCR扩增得到tRNA相关的约50bp的核心序列，该序列标记成探针，与基因组文库杂交，筛选出SINEs。5、A-PCR法，也称改进的A-B PCR法。引物A在基因组内进行PCR，弥散的PCR产物构建文库，A-B PCR产物标记后扫描该文库，筛选阳性克隆并测序，获得BoxA下游序列；根据已知序列设计正反引物，标记PCR产物并用作探针，扫描基因组文库，得到全长的SINEs序列。6、磁珠富集法。该方法以A-B PCR法为基础，获得约50bp的核心序列，再以反向PCR法获知核心序列两侧序列，以该序列为探针，通过生物素标记使此序列与磁珠耦合，然后与基因组文库杂交，捕获并分离基因组内SINEs。
以上用于分离SINE的方法，关键在于SINE核心序列的特异性，但所涉及获取核心序列的步骤都较为繁锁，且仅适用于特定的生物类群。本发明利用两次单引物PCR，无需体外转录、扫描基因组文库、或反向PCR，便能实现快速有效的分离鱼类SINE的核心序列，以此序列标记为探针，通过该探针与基因组文库杂交或与磁珠耦合后再与基因组文库杂交， 将可获得鱼类SINE全长序列。发明内容
本发明旨在提供一种基于PCR分离鱼类基因组DNA中SINE的方法，该方法简单， 通过两次单引物PCR扩增，就能直接获取基因组DNA中SINE的片段。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明
①实验材料鲱形目觸科鲂属的刀鲂Coilia nasus、凤鲂C. mystus和七丝鲂 C. grayi ;黄鲫属的黄鲫Setipinna taty ;棱觸属的赤鼻棱觸Thrissa kammalensis ;小公鱼属的中华小公鱼Anchoviella Chinensis0鲇形目鳄科黄颡鱼属黄颡鱼Pelteobagrus fulvidracoo S卢形目弹涂鱼科大弹涂鱼属大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris。
②提取DNA :剪取一小块新鲜的肌肉组织(约50g)，用DNA裂解酶56°C水浴消化 2-3小时，然后按照上海生工的UNIQ-1O柱式基因组DNA提取试剂盒进行操作，I %的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量，_20°C保存备用。
③引物B设计(见附图1):根据不同鱼类的 tRNA的聚合酶III的Box B序列高度保守性特点，设计I个独特引物B，由上海生工公司合成，弓丨物序列5’ -GAGGAYTTGAACC-3’。
④B-PCR :使用 Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, German) PCR 仪进行扩增，每个反应体积为50ul，包含基因组DNA 100叩，(1见13各0.41，引物0.51^&9酶21反应程序为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，44°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环;最后72°C 延伸lOmin。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)，选取刀鲚约300bp、500bp和 IOOObp的电泳条带进行克隆和测序分析。
⑤引物A设计(见附图1):根据步骤④获得的序列，比对分析BoxA序列，设计单引物A，引物序列为5’ -TGGCCTAGTGG-3’，由上海生工公司合成。
⑥A-PCR=PCR反应条件、体系及程序似同步骤④，仅退火温度稍有差异，为43°C。 PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测结果见附图3。
⑦序列分析选取刀鲂约500bp、700bp、IOOObp和1400bp的条带进行大肠杆菌 DH5a克隆，随机挑取克隆由上海生工公司进行测序。序列特点分析(附图3)可见，具有生物基因组DNA中SINE的基本结构特征，SINE的头部包括Box A和Box B两个结构域，躯干部为一个变化区，尾部具有正向重复序列或poly (A/T)。
综上所述，运用此实验方法，可扩增出鱼类基因组DNA中的反转座子SINEs，将可进一步用于基因工程、分子标记和生物进化方面的研究。
图1是分离SINE的B-PCR和A-PCR弓丨物设计示意图
图2是鱼类基因组B-PCR (左)和A-PCR (右)扩增产物电泳图。
电泳图谱中O :空白对照；M :分子量标准；1 :弹涂鱼；2 :黄颡鱼；3 :中华小公鱼；
4 :赤鼻棱鍉；5 :黄鲫；6 :七丝鲚；7 :凤鲚；8 :刀鲚
附图3A-PCR扩增的刀鲚SINE家族不同元件的序列比对。实框SINE的Box A和 Box B ;虚框正向重复序列；下箭头略去了一段插入序列；单、双下划线局部正向重复;波浪线poly(A/T)或可 能的poly(A) 碱基缺失。
权利要求
1. 一种分离鱼类基因组DNA的SINE的方法，其特征在于使用一个引物 B(5’ -GAGGAYTTGAACC-3’ )对基因组进行第1次PCR扩增，扩增产物克隆测序；使用一个引 物A (5’ -TGGCCTAGTGG-3’)对基因组进行第2次PCR扩增，扩增产物克隆测序，分析序列特 点，获得SINEs。
全文摘要
本发明公开了一种基于PCR方法分离鱼类基因组DNA中的反转座子SINEs的方法，本发明包括2次PCR扩增和2次克隆测序，具体步骤如下①使用一个引物B对鱼类基因组DNA进行第1次扩增，回收扩增产物并克隆测序；②使用一个引物A对鱼类基因组DNA进行第2次扩增，回收扩增产物并克隆测序，分析序列特点，获得目的基因。该方法提供了一种快速、简便、高效的分离鱼类SINE的新途径。
文档编号C12N15/10GK103013990SQ20111028977
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者刘 东, 朱国利, 唐文乔, 郭弘艺 申请人:上海海洋大学