专利名称：用于筛查多发畸形综合征的组合探针的制作方法
用于筛查多发畸形综合征的组合探针技术领域
本发明属生物技术领域，涉及筛查多发畸形综合征的探针，尤其涉及用于筛查多发畸形综合征的多重连续探针扩增的组合探针。该探针可用于多发畸形综合征初步筛查。
背景技术：
先天畸形(congenital malformation, CA)是指出生时即存在的形态或结构上的异常；包括单发畸形(如唇裂、多指等)和多发畸形(multiple congenital malformation, MCA)。研究发现，有多种多发畸形是在某一原因作用下特异地组合而产生，成为畸形综合征。目前，医学上已经识别诊断的畸形综合征已达250余种；但由于多发畸形综合症表型存在明显的特异性和不均衡性，仅依靠临床达到准确诊断较为困难。
随着对于MCA遗传学病因的分子遗传学检测技术不断发展；70年代，染色体G带技术发现了显微镜下可见的染色体异常如缺失、重复、易位和倒置，但是传统光学显微镜对于染色体结构异常的最大分辨率在5-10Mb，高分辨率显带技术也就在3-5Mb，故而其诊断率仍小于5%。
目前，医学上通常采用检测基因组拷贝数变异的方法诊断上述综合征；该方法存在以下缺陷核型分析仅可以检测到大于5Mb的重复/缺失；定量PCR，通量低，不适于多位点的筛查检测；Array平台的芯片检测，成本明显高于MLPA，不适用于大样本量的筛查。
2004年两个研究小组在Nature和Science几乎同时发表论文,报道了人体内拷贝数变异(Copy number variations, CNVs)现象的存在,并因其在整个基因组中覆盖的核苷酸总数远远超过SNP的总数，受到广泛重视。所述CNVs广泛的存在人类基因组，拷贝数的变化将影响一个较宽区域的基因组序列和很多可能基因的变化，故而CNVs在研究人类遗传性疾病方面的巨大潜力。目前，有研究正在深入探讨人类基因组CNVs变异情况与疾病的关系，大量研究表明，精神性疾病、神经性疾病、先天性疾病等存在CNV的异常。所述的CNVs 主要指介于Ikb和3Mb的DNA片段多态性，处于显微镜和高分辨率观测范围之间，属于亚微观范畴，目前检测的技术方法较多，如荧光定量PCR、MLPA及以微阵列平台为基础的全基因组分析技术，其诊断率达到15%。
有关用于筛查多发畸形综合征的多重连续探针扩增的探针的研制已引起本领域研究人员的关注。发明内容
本发明的目的是提供筛查多发畸形综合征的探针，尤其涉及用于筛查多发畸形综合征的多重连续探针扩增的组合探针。
本发明所述的探针能对发病率相对较高、病因为染色体结构重复或缺失、临床变现为多发畸形的13个常见多发畸形综合征进行早期筛查。所述的多发畸形综合征包括， 1ρ36缺失综合征、Sotos综合征、18三体综合征、CHARGE综合征、Williams Beuren综合征、 22qll缺失/重复综合征、21三体综合征、Smith Magenis综合征、13三体综合征、Cri duChat综合征、Prader Willi综合征、Wolf Hirschhorn综合征和17q21. 31缺失综合征。
具体而言，本发明的用于筛查多发畸形综合征的多重连续探针扩增的组合探针， 其特征在于，其包括1ρ36缺失综合征、Sotos综合征、18三体综合征、CHARGE综合征、 Williams Beuren综合征、22qll缺失/重复综合征、21三体综合征、Smith Magenis综合征、13三体综合征、Cri du Chat综合征、Prader Willi综合征、Wolf Hirschhorn综合征和 17q21. 31缺失综合征的关键基因或关键区域内的基因、或重复/缺失片段内两端的基因， 以及满足相应条件的探针序列和弓I物序列，和磷酸化标记。
本发明的组合探针可用于上述13个常见的发病率较高的多发畸形综合征的早期筛查。
本发明中，所述的基因为病率相对较高、病因为染色体结构重复或缺失、临床变现为多发畸形的综合征及选择的目的基因，为
(I) 1ρ36 缺失综合征GABRD、SK1、TP73 ；
(2) Sotos 综合征NSD1 ；
(3) 18 三体综合征MC2R、DTNA, TCF4 ；
(4) CHARGE 综合征CHD7 ；
(5) Williams Beuren 综合征:CLIP2、ELN、UMKl ；
(6)22qll 缺失 / 重复综合征SNAP29、TBXl、ZNF74 ；
(7) 21 三体综合征KCNJ6、DYRK1A、RCANl ；
(8) Smith Magenis 综合征RA1、MFAP4 ;
(9) 13 三体综合征EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 ；
(IO)Cri du Chat 综合征CTNND2、TERT ;
(Il)Prader Willi 综合征0CA2、UBE3A、GABRB3 ；
(12) Wolf Hirschhorn 综合征MSX1、WHSCl、LETMl ；
(13) 17q21. 31 缺失综合征MAP3K14、MAPT。
本发明中，所述的探针采用化学方法合成。
本发明中，所选择的目的基因序列在http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat 获得，并区别标记编码区、SNP及重复序列。
本发明所述的组合探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为憐酸标记、右半探针序列、右通用引物序列；所述左、右探针序列与靶序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连。
本发明中，所述的左、右序列满足如下条件
(I)序列长度唯一性；
(2) GC含量在50 %左右；
(3) Tm 值彡 70 °C;
(4)在连接位点不含SNP ；
(5)无二级结构；
(6)在人类基因组内无相同重复序列；
(7)序列加通用引物，磷酸标记。
本发明中，所述序列的GC含量检测、Tm值检测采用Raw Probe软件；二级结构的检测http://mfold. rna. albany. edu在线进行:在人类基因组内是否为特异性序列，http:// genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlat 在线进行检测。
本发明中，所述的序列由SIGMA公司化学合成。
本发明合成后的序列，单个分装，粉末试剂；按照每个序列所标记的nmol值，加TE 稀释至100 μ M浓度储存，取出10 μ I储存液，加去离子灭菌水稀释至I μ M作为工作液；将所有序列混合，加去离子灭菌水最终稀释至lfmol/μ 1，制成工作浓度的探针混合液；
所述的探针混合液，用于多重连续探针扩增技术。
本发明中，所述试剂采用MRC公司的Ρ200探针空白试剂盒，操作步骤
1)DNA变性标记O. 2ml Eppendorf管或8联管；加入5 μ I DNA，其中DNA总量在 150-200ng ;放入PCR仪，启动MLPA程序98°C 5分钟，使DNA样本变性，冷却至25°C，取出；
2)杂交反应制备杂交混合液，每个反应包括1. 5μ I的MLPA缓冲液(黄色)+1. 5 μ I探针(黑色)，充分混匀。在PCR仪到达25°C时，每管加3 μ I杂交混合液，混匀；继续MLPA程序95°C I分钟，后60°C杂交16-20小时。
3)连接反应制备连接混合液，每个反应包括3 μ I连接酶-65缓冲液A(透明色)+3 μ I连接酶-65缓冲液B (白色)+25 μ I去离子水，充分混匀；每个反应加I μ I连接酶-65(绿色)，轻柔混匀；继续MLPA程序，在54 °C暂停；在PCR仪到达54°C时，每管加32 μ I 连接混合液，混匀；继续MLPA程序54°C 15分钟(连接)，98°C 5分钟使连接酶失活，后在 15°C暂停；
4)PCR反应标记新的PCR 8联管；制备PCR缓冲混合液，每个反应包括4 μ I SALSAPCR缓冲液(红色)+26 μ I去离子水，充分混匀；在新的8联管中，每管加入30 μ I PCR 缓冲混合液；于室温下，将10 μ I连接产物加入相应的新8联管中；制备聚合 酶混合液，每个反应包括2 μ I SALSA PCR引物(棕色)+2 μ I SALSA酶缓冲液(蓝色)+5. 5 μ I去离子水+0. 5 μ I SALSA聚合酶(橘红色)，轻柔混匀，使用前4°C保存。继续MLPA程序，在60°C 暂停；在PCR仪到达60°C时，每管加10 μ I聚合酶混合液，混匀；立刻继续MLPA程序35个循环95°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 60 秒，后 72°C 20 分钟，在 15°C暂停；
5)毛细管电泳检测PCR产物。
上述技术方案中，所有基本分子生物学操作均参照MRC公司的《Synthetic probe design》和《Protocol MLPA_v29》。
本发明的优点是；
提供用多重连续探针扩增技术的组合探针，针对发病率相对较高、由于染色体微结构重复或缺失、临床变现为多发畸形的综合征，如，1ρ36缺失综合征、Sotos综合征、18三体综合征、CHARGE综合征、WiIliams Beuren综合征、22qll缺失/重复综合征、21三体综合征、Smith Magenis综合征、13三体综合征、Cri du Chat综合征、Prader Willi综合征、Wolf Hirschhorn综合征和17q21. 31缺失综合征,根据上述综合征的已知关键基因、区域,进行临床分子诊断筛查，其中的多重连接依赖式探针扩增法(Multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)能克服突光定量PCR的缺点，一次能够分析40个序列，并具有更高的分辨率、灵敏度和可重复性；同时，所述的MLPA较微阵列平台的检测方法，更加经济、快捷，针对性一次能够分析多个序列，并具有更高的分辨率、灵敏度和可重复性的优点。同时，所述的多重连续探针扩增技术的组合探针较微阵列技术和FISH的检测方法经济、快捷，针对性更强，适合作为临床的常规检测方法。
本发明的组合探针，可用于上述13个常见的多发畸形综合征的初步筛查。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的用于筛查多发畸形综合征的组合探针进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
图1为本发明中探针序列模建图，其中，1、4为通用引物序列，2、3为与靶序列结合部位；5为祀序列，1+2为左探针,3+4为右探针。
图2为本发明中MLPA操作步骤PCR设定程序示意图。
图3为本发明中阴性病例检测结果原始图像，其中，
A中，浅色峰为每个位点正常人拷贝数水平，深色峰为病例拷贝数水平，检测病例各位点拷贝数与正常对照相同；
B中，浅色点代表每个位点的拷贝数水平，上下两条线分别为正常范围的上界和下界，检测病例各位点拷贝数均在正常范围。
图4为本发明中阳性病例检测结果原始图像，其中，
A中，浅色峰为每个位点正常人拷贝数水平，深色峰为病例拷贝数水平，21号染色体上3个位点(深色)，拷贝数高于正常对照；
B中，浅色点代表每个位点的拷贝数水平，上下两条线分别为正常范围的上界和下界，21号染色体上3个位点(深色)，拷贝数高于正常范围上限。
具体实施方式
实施例1.设计探针序列
(I)多发畸形综合征及其关键基因的选择
参考 http://www.ncb1.nlm.nih.Rov/sites/GeneTests/Review db = GeneTests中常见多发畸形综合征的描述，选择发病率相对较高、病因主要为染色体部分重复/缺失的综合征。并根据该描述及已发表的相关文献报道，选择关键基因或关键区域。若尚未明确关键基因或关键区域，选择重复/缺失片段两端各一、及中间位置3个基因，以代表该区段。
(2)设计探针序列
选择的目的基因序列在http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat获得,并区别标记编码区、SNP及重复序列。
针对每个目的基因，探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为憐酸标记、右半探针序列、右通用引物序列。左、右探针序列与目的基因的目的序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连，见图1。
左、右序列满足如下条件1)序列长度唯一性；2)GC含量在50%左右；3)Tm值^ 700C ；4)在连接位点不含SNP ；5)无二级结构；6)在人类基因组内无相同重复序列。
序列GC含量检测、Tm值检测采用Raw Probe软件，见图3 ; 二级结构的检测 http://mfold. rna. albany. edu在线进行，见图4 ;在人类基因组内是否为特异性序列, http: //genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlatR11IS 5。
(3)探针序列的合成
将设计好的序列，由SIGMA公司合成。
实施例2鉴定探针
(I)阴性病例对照
选择正常人群,提取全基因组DNA后,进行MLPA实验,米用Genemarker Demol. 97 版本软件，进行数据分析。见图3。
(2)阳性病例对照选择I例Sotos综合征、I例18三体综合征、I例22qll缺失/ 重复综合征、I例21三体综合征、I例13三体综合征、I例Cri du Chat综合征、I例Prader Willi经Affymetrix 2. 7M芯片检测验证，明确诊断为相应综合征患者作为阳性对照，提取全基因组DNA后,进行MLPA实验,米用Genemarker Demo1. 97版本软件,进行数据分析。见图4。
实施例3检测多发畸形病例
选取复旦大学附属儿科医院新生儿病房住院的59例多发畸形患儿，提取全基因组DNA后,进行MLPA实验,采用Genemarker Demo1. 97版本软件,进行数据分析。共发现阳性病例13例，发现率22. 03%为。分别为21三体7例，5pl5缺失2例，22qll重复I例、 缺失I 例，5q35缺失I例，15qll-ql3缺失I例。
权利要求
1.用于筛查多发畸形综合征的组合探针，其特征在于，其包括1ρ36缺失综合征、Sotos综合征、18三体综合征、CHARGE综合征、Williams Beuren综合征、22qll缺失/重复综合征、21三体综合征、Smith Magenis综合征、13三体综合征、Cri du Chat综合征、Praderffilli综合征、WolfHirschhorn综合征和17q21. 31缺失综合征的关键基因或关键区域内的基因、或重复/缺失片段内两端的基因，以及满足相应条件的探针序列和引物序列，和磷酸化标记。
2.根据权利要求1所述的用于筛查多发畸形综合征的组合探针，其特征在于，所述的基因为(1)1ρ36 缺失综合征=GABRD, SK1、TP73 ；(2)Sotos 综合征=NSDl ；(3)18 三体综合征MC2R、DTNA, TCF4 ；(4)CHARGE 综合征CHD7 ；(5)Williams Beuren 综合征:CLIP2、ELN、UMKl ； (6)22qll缺失 / 重复综合征SNAP29、TBX1、ZNF74 ；(7)21 三体综合征KCNJ6、DYRK1A、RCANl ；(8)Smith Magenis 综合征RA I > MFAP 4 ；(9)13 三体综合征EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 ；(10)Cridu Chat 综合征:CTNND2、TERT ；(11)PraderWilli 综合征:0CA2、UBE3A、GABRB3 ；(12)WolfHirschhorn 综合征MSX1、WHSCl、LETMl ；(13)17q21. 31 缺失综合征MAP3K14、MAPT。
3.根据权利要求1所述的用于筛查多发畸形综合征的组合探针，其特征在于，所述的探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5’端至3’端依次为左通用引物序列、左半探针序列；右半序列5’端至3’端依次为磷酸标记、右半探针序列、右通用引物序列；所述左、右探针序列与靶序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连； 所述的左、右序列满足如下条件 (1)序列长度唯一性； (2)GC含量在50 %左右；(3)Tm 值彡 700C ； (4)在连接位点不含SNP； (5)无二级结构； (6)在人类基因组内无相同重复序列； (7)序列加通用引物，磷酸标记。
4.根据权利要求3所述的用于筛查多发畸形综合征的组合探针，其特征在于，所述的探针采用化学方法合成。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及筛查多发畸形综合征的探针，尤其涉及用于筛查多发畸形综合征的多重连续探针扩增的组合探针。本发明选择1p36缺失综合征、Sotos综合征、18三体综合征、CHARGE综合征、Williams Beuren综合征、22q11缺失/重复综合征、21三体综合征、Smith Magenis综合征、13三体综合征、Cri du Chat综合征、Prader Willi综合征、WolfHirschhorn综合征和17q21.31缺失综合征的关键基因或关键区域内的基因、或重复/缺失片段内两端的基因，根据所述基因的序列，选择满足相应条件的作为探针序列；在所述的探针左半序列5’端和右半探针3’端加通用引物序列，并加磷酸化标记，合成多重连续探针扩增的组合探针；该探针可用于多发畸形综合征初步筛查。
文档编号C12N15/11GK103014141SQ20111028892
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者周文浩, 杨琳, 马端, 王慧君 申请人:复旦大学