专利名称：肠道病毒三联实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种三探针实时荧光定量RT-PCR检测患儿粪便、咽式子、血液、脑脊液等样本中肠道病毒通用型(EV)、 肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分型及定量的新方法。本品以肠道病毒高度保守的5’非编码区(UTR)为靶序列，设计肠道病毒通用引物和肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型三色荧光标记探针，利用一步法三色实时荧光定量RT-PCR 技术，达到早期、快速、准确检测所有肠道病毒及分型的应用目的。
背景技术：
手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒71型 (EV 71)等均能引起手足口病。其中以EV 71及Cox A16型最为常见。二者所致的手足口病临床难以区别。与CA16不同，EV71不仅引起手足口病，而且可引起严重中枢神经系统并发症，如脑炎、脑膜炎、急性迟缓性瘫痪等，重者死亡。肠道病毒引起的手足口病、病毒性脑炎等疾病潜伏期一般为3 7天，没有明显的前驱症状，多数病人突然起病。早诊断、早治疗至关重要。目前，对于肠道病毒引起的手足口病、病毒性脑炎等疾病实验室仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。传统的肠道病毒检测有病毒分离培养和血清学诊断，前者曾被视为肠道病毒诊断的“金标准”，但操作繁琐、较为费时，一般需4-15天，且存在操作繁琐、敏感性低，远远不能满足疾病预防的“四早”要求； 而血清学诊断最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是常常只能作为回顾性诊断的依据，而且容易与其它病毒产生交叉反应，所以抗体法无助于早期诊断。随着分子生物学技术的迅速发展，应用聚合酶链反应技术为病原微生物的检测提供了新的方向，特别近几年兴起的实时荧光定量PCR法。该方法通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算出初始模板量。该法除定量准确、检测快速外，其最大优点是采用完全闭管检测，避免了交叉污染，广泛被科研和临床所接受。随着荧光定量PCR检测仪器的更新和染料科学的发展，不同肠道病毒属间的检测可用不同的荧光素标记特异探针，运用多重反转录荧光定量PCR( RT-qPCR)技术，可对临床最常见的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)同时进行检测；而根据文献报道和对肠道病毒属脊灰病毒、柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒68 71型等各型病毒株全基因组分析发现，各型肠道病毒5’非编码区(UTR)存在着高度保守的区域，可以用来设计并扩增检测所有肠道病毒株。从而实现对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒 A组16型三联同时检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒由定量RT-PCR反应液、标准品、对照品和盒体组成，其中定量RT-PCR反应液含有 RT-PCR缓冲液、MgCl2 , dNTPs、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16 型荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反转录酶(Primekript RTase酶)。检测用引物分上游引物和下游引物
上游引物序列为CCCTGAATGCGGCTAATCC 下游引物序列为GATTGTCACCATAAGCAGCC 检测用各分型荧光探针序列和各自的荧光素标记物 EV 通用型荧光探针为 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型荧光探针为HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3~ BHQ-I
CA16 型荧光探针为ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
标准品序列为
CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCAC AAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为 EV71型灭活病毒株样品，购自中山大学达安基因公司。本定量试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本发明试剂盒使用方法
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为IXlO4 — IX IO7拷贝。肠道病毒核酸RNA提取严格按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit (QIAGEN，CAT :5四04)操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA。取5μ1提取RNA作为RT-PCR模板。扩增检测在三色(或以上)荧光定量PCR仪上进行，总体积25 μ 1，其中20. 0μ 1 PCR反应液，5 μ 1检测样品(提取产物、标准品、阳性或阴性对照)；探针检测模式设置为 Reporter Dye :FAM, HEX和ROX通道，分别用于检测EV通用型、EV71型和CA16型；反应条件45°C 10分钟，1个循环，94°C 2分钟，1个循环，94°C 15秒一60°C 60秒，40个循环。 设置完成后，保存文件，运行程序。荧光定量结果报告
1.如果检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct值>40，可判样品为非肠道病毒 (NEV)；
2.如果检测样品Ct值<38，且曲线有明显的对数增长期，可判样品为阳性；
3.如果检测样品38< Ct值< 40，需要对样品重新进行核酸提取和检测操作，若再次实验结果Ct值< 38，且曲线有明显的对数增长期，判样品为阳性；若Ct值> 38，可判样品为阴性，具体是否属于肠道病毒通用型、肠道病毒71型、柯萨齐病毒A组16型，请按照表1决定。
表1
ii^fe^i FiLT-F1CR 结巢果EV (-)EV71 (-),CAl6 (-)非肠道推『毒(NEV)EV ( + )EV71 (-),CAl6 (_)非 EV.71,CAl 6的其它肠道病毒EV ( + )EV71 ( + )’CAl6 (-)EV71EV ( + )EV71 (-),CAl 6 ( + )CAl 6本发明试剂盒通过一步法同时对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A 组16型进行检测分型，比起市场上现有的三个独立分开的检测试剂盒，不仅节约了生产成本和检测成本，同时也提高了检测的效率和时间；另外我们引入通用引物和分型探针设计技术，在保证没有多对引物竞争的条件下随机自动的达到多通道的检测目的，上述的设计发明达到了效率和技术的统一。
图1为本发明试剂盒的结构示意图。图2为肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR扩增图。图3为肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施例方式本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1
参见图1，本发明提供一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂由定量RT-PCR反应液1、标准品2、阳性对照品3、阴性对照品4和盒体5组成，其中定量 RT-PCR反应液1含有RT-PCR缓冲液、MgCl2 ,dNTPs、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71 型荧光探针、CA16型荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反转录酶(Primekript RTase 酶)。检测用引物分上游引物和下游引物
上游引物序列为CCCTGAATGCGGCTAATCC 下游引物序列为GATTGTCACCATAAGCAGCC 检测用各分型荧光探针序列和各自的荧光素标记物 EV 通用型荧光探针为 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型荧光探针为HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - BHQ-I
CA16 型荧光探针为ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
标准品序列为
CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCACAAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC
阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为EV71型灭活病毒株样品，购自中山大学达安基因公司。本发明试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2 肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒敏感度和特异性实验
一、材料
选取病原微生物包括如下实验组柯萨奇病毒A组16型，肠道病毒EV71型，柯萨奇病毒B组3型和埃可病毒30型等肠道病毒株；对照组甲型肝炎病毒，轮状病毒，乙型炎病毒，人巨细胞病毒和肺炎支原体等，上述病源毒株均购自中山大学达安基因公司。二、引物及探针设计与合成
对肠道病毒UTR区核酸序列进行生物信息学分析，应用DNA STAR等软件分析序列的同源性和各型的差异性，设计并筛选EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16 型荧光探针。上游引物序列为CCCTGAATGCGGCTAATCC
下游引物序列为5，一 GATTGTCACCATAAGCAGCC 一 3， EV 通用型荧光探针为 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型荧光探针为HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - BHQ-I
CA16 型荧光探针为ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
均由上海生工公司合成。
三、检测标准品制备
用上述引物扩增肠道病毒EV71型病毒株，在上游引物的扩增位点引入CA16型检测探针序列CACGCACCCTCAACCCAGG，构建成一个同时拥有EV通用型、EV71型和CA16型均为单拷贝的一个重组序列片段；该片段提取纯化后即用克隆系统插入PGEM-T-Easy克隆载体，抽提重组克隆质粒，用分光光度计对质粒进行定量，并用无菌水以10倍比稀释质粒进行荧光定量PCR的敏感度实验。四、检测试剂盒特异性、敏感度和标准品相关系数分析
采用肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR试剂盒对上述常见病原微生物进行检测，实验组柯萨奇病毒A组16型，肠道病毒EV71型，柯萨奇病毒B组3型和埃可病毒30型等检测均为阳性，且CA16型在通用型检测通道(FAM通道)和CA16型检测通道(R0X通道)为双阳性，EV71型在通用型检测通道(FAM通道)和EV71型检测通道(VIC通道)为双阳性。而对照组中的甲型肝炎病毒，轮状病毒，乙型炎病毒，人巨细胞病毒和肺炎支原体等检测结果均为阴性，特异性为100%;用构建的质粒标准品倍比稀释后检测敏感性达到10拷贝；用已知定量的浓度梯度标准品IO4 IO5 IO6 IO7四个浓度梯度做标准曲线，标准曲线中的ct值与标准质粒拷贝数之间有良好的线性关系(图2、图3)，肠道通用型、EV71型和CA16型的相关系数 R2 分别=0. 998,0. 996 和 0. 998。实施例3 肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒临床样本检测应用一、标本检测
6选取2010年5月 2010年10月手足口病流行期间，我院门诊及住院的疑似手足口病患儿粪便标本192例和咽拭子标本215例。选取由中山大学达安基因股份有限公司提供的， 经国家食品药品监督管理局注册批准的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒、EV71型核酸检测试剂盒和CA16型核酸检测试剂盒为对照，用于评价本申请试剂盒的性能指标。
二、临床样品对照检测结果
粪便标本192例和咽拭子标本215例肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和达安公司生产的单联三管对照试剂结果见表2、表3
轰2 192例粪便样本
权利要求
1. 一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，由定量RT-PCR反应液(1)、标准品(2 )、阳性对照品(3 )、阴性对照品(4 )和盒体(5 )组成，其中定量RT-PCR反应液(1)有 RT-PCR缓冲液、MgCl2 , dNTPs、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16 型荧光探针、耐热DNA聚合酶、反转录酶，检测用上游引物序列为检测用下游引物序列为5 - CCCTGAATGCGGCTAATCC -3 GATTGTCACCATAAGCAGCC-3“ EV 通用型荧光探针序列为5~FAM—ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - 3~ BHQ-I EV71 型荧光探针序列为HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3~BHQ-I CA16 型荧光探针序列为ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2 标准品序列为CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCAC AAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC 阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为EV71型灭活病毒株样品。
2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
3.根据权利要求1所述的一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，标准品(2)用无菌去离子水稀释为IXlO4 — IXlO7拷贝。
全文摘要
本发明提供一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、标准品、对照品，其中定量RT-PCR反应液含有RT-PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16型荧光探针、耐热DNA聚合酶、反转录酶。本发明试剂盒通过一步法同时对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型进行检测分型，比现有的单个检测试剂盒，不仅节约了生产成本和检测成本，同时也提高了检测的效率和时间。并在保证没有多对引物竞争的条件下随机自动的达到多通道的检测目的，达到效率和技术的统一。
文档编号C12Q1/68GK102367488SQ20111028904
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者吴亦栋, 尚世强, 杜立中, 陈志敏 申请人:浙江大学