一种用于检测日本乙型脑炎病毒的荧光rt-pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种用于检测 日本乙型脑炎病毒的荧光RT-PCR试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)引起的中 枢神经系统损害的一种急性人畜共患病毒性脑炎。乙型脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属， 与西尼罗病毒、登革热病毒同属。该病毒可通过蚊子的叮咬传播，三带喙库蚊是主要传播媒 介。人类感染乙脑后，死亡率在20% -50%，疾病治愈后多数幸存者存在中枢神经系统后遗 症。猪是JEV感染环节中重要的中间宿主、扩增宿主，乙脑病毒可以导致母猪繁殖障碍、公 猪睾丸炎，造成养殖业重大经济损失。同时研宄表明，猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑 炎密切相关，因此了解乙脑在猪群的流行不仅可以降低经济损失，也是防控人患乙脑的重 要措施。
[0003] 目前，已有的乙脑检测标准为GB/T 18638-2002《流行性乙型脑炎诊断技术》，本标 准主要规定了流行性乙型脑炎的病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验、补体结合试验、血凝 抑制试验。国家随后发布了 GB/T22333-2008《日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验 方法》，但是该标准只能对乙脑进行普通RT-PCR检测，PCR技术应用在乙型脑炎病毒监测等 方面已经发挥了重要作用，但近几年迅速发展和推广的实时荧光PCR技术，基本取代了以 往所有的大批量标本监测方法。乙型脑炎病毒在我国的分布，除了新疆、西藏和青海三省区 以外，其余的所有省市区均存在乙型脑炎病毒。我国第一株乙型脑炎毒株是1949年在北京 分离到的，此后在我国不断分离到不同的乙型脑炎毒株，但在2001年以前，我国的乙型脑 炎毒株全部属于GIII型病毒。2001年王环宇等从上海市郊区采集的三带喙库蚊中分离到了 7株乙型脑炎病毒，通过病毒PrM区段（456~695位核苷酸）的基因分型显示，新分离的7 株病毒属于基因I型乙型脑炎病毒，这是我国首次报道分离到基因I型乙型脑炎病毒。
【发明内容】
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[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测日本乙型脑炎病毒 的荧光RT-PCR试剂盒，所述的这种用于检测日本乙型脑炎病毒的荧光RT-PCR试剂盒解决 了现有技术中的检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒时间长、程序繁琐、成本太高，不利于大量 样本的检测的技术问题。
[0005] 本发明提供了一种用于检测日本乙型脑炎病毒的荧光RT-PCR试剂盒，包括含有 引物和探针的PCR反应液，其中，上游引物的序列如SEQ ID N0 :2所示，下游引物的序列如 SEQ ID N0 :3所示，探针的序列如SEQ ID N0 :4所示，所述的探针的5'端标记有报告荧光 基团，所述的探针的3'端标记有淬灭荧光基团。
[0006] 进一步的，还含有热启动Taq酶和RT反转录反应液。
[0007] 本发明还提供了采用上述的试剂盒检测日本乙型脑炎病毒的方法，包括如下步 骤：
[0008] (1)按照检测样品数n (n =待检样品数+2)取RT-PCR反应液、热启动Taq酶和探 针等混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用；
[0009] (2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的RNA加入对应反应管中；最后 取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；
[0010] (3)荧光RT-PCR反应条件：42°C 5min，95°C预变性10s，按以下参数循环40次： 94°C变性5sec、60°C采集荧光lmin。60°C时荧光检测，检测通道：FAM和TAMRA ;
[0011] (4)结果判定：若Ct值> 35或无数值的标本为阴性；FAM通道Ct值彡30的标本 为阳性标本；30 < Ct值< 35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。
[0012] 进一步的，上述检测方法的质控标准如下：
[0013] (1)阴性对照的Ct值应等于none ;
[0014] (2)阳性对照的Ct值应彡30,否则，此实验视为无效；
[0015] (3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
[0016] 本发明对用于猪日本乙型脑炎病毒的引物和探针在NCBI的GenBank中进行了 Blast验证，证明所设计引物和探针具有良好的特异性，并进行了实样检测，证明了该引物 和探针与其他病原没有交叉；另一方面，本发明对反应参数进行了优化，验证了其对猪日本 乙型脑炎病毒的检测灵敏度。
[0017] 本发明可以在实时荧光PCR仪上进行日本乙型脑炎病毒实时快速的检测，既可以 快速得到准确的结果，同时也大大减轻工作量，最后根据这些阳性标本进一步进行病毒分 离。
[0018] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本方法的试剂制备简单、方法 简便快捷、特异性强、敏感性高、结果判断容易。通过本发明的试剂盒，可以迅速的检测日本 乙型脑炎病毒所致的日本乙型脑炎，从而尽快的预防治疗日本乙型脑炎。
【附图说明】：
[0019] 图1是TaqMAN荧光探针法检测JEV的原理图之一。
[0020] 图2是TaqMAN荧光探针法检测JEV的原理图之二。
[0021] 图3是TaqMAN荧光探针法检测JEV的原理图之三。
[0022] 图4是JEV阳性质粒的标准曲线，其斜率为-3. 357, R2值分别为0. 996。
[0023] 图5是JEV的特异性实验。
[0024] 图6是JEV荧光RT-PCR灵敏度检测结果。
[0025] 图7是JEV RT-PCR灵敏度检测结果
[0026] 图8是JEV的稳定性试验。
[0027] 图9是-20°C JEV的保存期试验。
【具体实施方式】：
[0028] 实施例1
[0029]1、引物、探针的设计和优化
[0030] 序列来源：通过NCBI基因库检索了猪日本乙型脑炎病毒多个病毒株，并从基因库 中下载了株代表株，代表株其登录号为JX040321. 1，通过序列比对，最终选用了猪日本乙型 脑炎病毒基因组中prM区域中序列作为引物和探针序列设计的参考序列。
[0031] prM代表序列参考序列如SEQ ID N0 :1所示，全长501bp。
[0032]通过引物设计软件（Primer Express 3. 0? 1)，设计了如下的序列：
[0033] 上游引物 J1 :5' -ACCAAGAAGTCTACGTCCAATATGG-3'（如 SEQ ID N0 :2 所示）；
[0034] 下游引物 J2 :5' -ITGGACCGACACGGATCTC-3'（如 SEQ ID N0 :3 所示）；
[0035] TaqMan 探针序列：5' [FAM]-TGCACGCGGACCAGGCAITC-[TAMRA]3'，（如 SEQ ID N0 : 4所示）；
[0036] 探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等 具体情况另行选定。
[0037]2、样品的采集和提取的优化处理
[0038] 2.1样品的采集
[0039] 针对采集样品的特性，对样品的处理方法进行优化，以确保样品质量，为有效提取 奠定基础。
[0040] 取样要求：
[0041] 2. 1. 1 血清
[0042] 待检活猪用注射器采血2~4mL，4~10°C储存送至实验室。待凝固后，2000~ 4000r/min离心5min，取上清_20°C保存备用。
[0043] 2. 1. 2 精液
[0044] 将冷冻精液样品解冻或新鲜精液样品，分装lmL到1. 5mL微量离心管中，振荡混 勾，采用5000r/min离心30s，取上清-70°C保存备用。
[0045] 2. 1. 3组织样品
[0046] 无菌采集濒死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织，取lg组织剪碎，与2mL PBS制 成悬液，5000r/min离心20min，收集上清，-70°C保存备用。
[0047] 2. L 4细胞培养液
[0048] 细胞培养液冻融2~3次，分装到1. 5mL微量离心管中，4000r/min离心lmin，取 上清备用。
[0049] 2. 2RNA 提取
[0050] 2. 2. 1有机溶剂抽提法
[0051] 仅用于血清、组织样品和细胞培养液。取200 yL处理好的待检样本或对照，用1ml Trizol试剂对其进行裂解，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；在上述EP管中，按照每 lml Trizol后加0. 2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温 下（15~30°C )放置2~3分钟后，12000g(2~8°C )离心15分钟；取上层水相置于新EP 管中，按照每lml Trizol加0? 5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30°C )放置10 分钟后，12000g(2~8°C )离心10分钟；弃上清，按照每lml Trizol加lml 75%乙醇进行 洗涤，涡旋混合，7500g (2~8°C )离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温在自然干燥；用 Rnase-f