一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的dna核酸适配体及其筛选方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可用于细胞水平和组织水平上石斑鱼 虹彩病毒（SGIV)感染检测的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 核酸适配体是由指数富集的配基系统进化技术（SELEX)筛选得到的一类新型检 测和治疗工具。指数富集的配基系统进化技术是一类广受关注的新型检测和治疗的生物文 库技术。它利用人工合成的、容量约为1〇 14~10 15的随机寡核苷酸文库与靶物质结合，经过 多轮筛选获得靶物质的核酸适配体。利用该技术筛选得到的核酸适配体具有与单克隆抗体 相当的高特异性和高亲和性，由于筛选是在体外进行的化学过程，所以从金属离子、有机染 料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为筛选对象，而且核酸适配体没有免 疫原性，温度变化引起的变性是可逆的，筛选时间短费用低，得到的核酸适配体易于合成和 修饰。因此，核酸适配体不仅在新药研发领域具有广阔前景而引人瞩目，其在重大疾病的生 物医学基础研宄、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。
[0003] 我国是水产养殖大国，石斑鱼是最名贵的海水养殖鱼类之一，具有极高经济价值。 然而，近年来在石斑鱼中暴发和流行的虹彩病毒等严重地威胁了石斑鱼的海水养殖，造成 了巨大的经济损失。目前国际上在水产动物疾病，包括石斑鱼虹彩病毒快速诊断的方法主 要包括基于细菌学、病毒学、寄生虫学及组织病理学的传统方法，基于抗体的免疫学检测方 法，针对特异性病原的抗体的血清学检测技术以及分子生物学技术等。这些方法各有优点 同时也存在严重不足，所以必须着力开发新型的、特异性更强、灵敏性更高、操作更简便的 核酸适配体来检测和控制石斑鱼虹彩病毒（SGIV)感染。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、稳定易修饰、 便于合成和保存的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体。
[0005] 本发明的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述的核苷酸序列上结合有用于检测的标记。
[0006] 上述DNA核酸适配体，其核苷酸序列上的任一位置可以被磷酸化、甲基化、氨基 化、疏化或同位素化。
[0007] 所述的用于检测的标记优选为：异硫氰酸荧光素（FITC)、羧基四甲基罗丹明 (TAMRA)、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
[0008] 上述DNA核酸适配体，不论是经部分取代或者经过修饰后，都具有与原核酸适配 体基本相同或者类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于石斑鱼虹彩病毒（SGIV)检 测。
[0009] 本发明的第二个目的提供一种上述DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包 括以下步骤：
[0010] ⑴、合成以下随机单链DNA文库和引物：
[0011] 随机文库 Library50 :
[0012] 5? -GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
[0013] 5' 引物：5' -FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ；
[0014] 5' 引物：5' -TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ；
[0015] 3' 引物：5' -Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3' ；
[0016] (2)、Cell-SELEX筛选流程：用石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞， 细胞继续培养48h，去除培养基后用缓冲液洗涤被感染的GS细胞，将步骤（1)中的随机文库 溶解后首先与正常GS细胞在冰上孵育结合0. 5h得到上清，然后将上清与被感染的GS细胞 进行孵育结合lh，孵育完成后去除液体并用缓冲液洗涤GS细胞，然后将洗涤后的GS细胞于 85~94°C加热2~lOmin，离心得到上清1，将上清1与正常的GS细胞在冰上孵育结合，用 与得到上清1相同的方法得到上清2,即为被虹彩病毒感染的GS细胞的特异性核酸适配体 文库；
[0017] (3)、文库扩增：利用步骤（1)中的合成的引物对步骤（2)中筛选得到的特异性核 酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增产物双链DNA ;
[0018] (4)、DNA单链文库的制备：将链酶亲和素标记的磁珠与步骤（3)中的双链DNA在 常温下孵育，利用双链DNA上的标记与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁 珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，将上清液通过除盐柱收集到含有DNA 单链文库的溶液；
[0019] (5)、重复多轮筛选：将步骤（4)中收集的DNA单链文库代替步骤（2)中的随机文 库，重复以上步骤（2)-(4)至少14次，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正 常GS细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选 过程中，文库与正常GS细胞结合时间从0. 5h增加至lh，文库与病毒感染细胞结合时间从 lh缩短至0. 5h，以提高每轮的筛选效率，即得到用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸 适配体。
[0020] 优选，步骤⑵中所述的培养基为L15培养基。
[0021] 优选，步骤⑵中所述的缓冲液为PBS缓冲液。
[0022] 优选，步骤（3)中所述的PCR扩增，其扩增体系为lOOOy 1 :10Xbuffer 100y 1， (1阶？(2.51111)80 111，模板100 111，5'引物30 111，3'引物30 111，1^&1酶10 111，（181120 650 y 1 ;扩增程序为：94 °C 2min，94 °C lmin，60 °C 30sec，72 °C lmin，经过 12 轮循环， 72°C 5min〇
[0023] 步骤（4)中所述的回收得到上清液，优选通过磁性分离架回收。
[0024] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的试剂盒，其特征 在于，含有上述SEQ ID N0:1所示的DNA核酸适配体。
[0025] 本发明的第四个目的是提供上述用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配 体在进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测中的应用。
[0026] 本发明将随机DNA单链文库首先与正常细胞在冰上孵育后，回收到的上清1与被 病毒感染的GS细胞在冰上孵育，收集感染细胞高温变性回收到上清2后，再次与正常细胞 冰上孵育，从而最大限度地去除与正常细胞结合的非特异单链DNA，实现提高筛选效率的目 的。
[0027] 与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明通过优化的细胞SELEX筛选得到 的核酸适配体，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体 所不具备的特点，包括无免疫原性；分子量小，便于体外化学合成；易于对核酸适配体的不 同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存；制备周期短，重现性好；便于标记等。 采用本发明的核酸适配体进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测时，操作简单迅速，可以在细胞 水平和组织水平上检测到虹彩病毒的感染，解离常数均在纳摩尔范围以内，并应用于相关 的检测试剂盒。这对于虹彩病毒感染的快速检测具有重要意义，在虹彩病毒感染的检测领 域有良好的应用前景。
【附图说明】：
[0028] 图1是本发明实施例中流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素（FITC)标记的第9轮、10 轮、11轮、12轮、13轮、14轮筛选文库与被虹彩病毒感染的GS细胞的结合情况，其中，A为 感染SGIV的GS靶细胞，B为正常的GS对照细胞；
[0029] 图2是本发明实施例中流式细胞仪检测筛选得到的异硫氰酸荧光素（FITC)标记 的序列1的核酸适配体与被虹彩病毒感染的GS细胞结合能力的检测结果；
[0030] 图3是本发明实施例中羧基四甲基罗丹明（TAMRA)标记的序列1的核酸适配体与 被虹彩病毒感染的GS细胞、正常GS细胞染色荧光强度差异比较（图中的两组图片，左边是 明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息）；
[0031] 图4是本发明实施例中羧基四甲基罗丹明（TAMRA)标记的序列1的核酸适配体与 被虹彩病毒感染的石斑鱼肝脏组织、正常石斑鱼肝脏组织染色荧光强度差异比较（图中的 两组图片，左边是明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息）。
【具体实施方式】：
[0032] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施例中的 实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的实验材料如无特殊说明，均是从常 规的生化试剂公司购买所得到。
[0033] 实施例1 :
[0034] 1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物
[0035] 随机文库 Library50 :
[0036] 5 ' -GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
[0037] 5' 引物：5' -FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3'；
[0038] 5' 引物：5' -TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3'；
[0039] 3' 引物：5' -Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3'；
[0040] 2、Cell-SELEX筛选获得特异性识别被SGIV感染的GS细胞的核酸适配体
[0041] 2. 1 L15培养基中加入10%胎牛血清培养GS细胞至铺满培养瓶底95%，在培养 瓶中加入石斑鱼虹彩病毒（SGIV)，石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞，继续 培养48h后，去除被病毒感染的细胞的培养瓶中的培养基，用15ml PBS洗涤被感染的GS细 胞；
[0042] 2.2将lOnmol上述随机文库溶解在300 yl binding buffer中，95°C恒温水浴 5min，然后迅速插入冰中，冰浴lOmin，用binding buffer补充至lmL，将处理后的随机文库 与2. 1中被SGIV感染的GS细胞在冰上孵育lh ;
[0043] 2. 3孵育结合完成后，将培养瓶中的液体除去，用10mL的PBS洗涤培养瓶中细胞； 用细胞刮刀将细胞刮下并混匀在lmL PBS中，将细胞混液转移到EP管中，94°C恒温水浴 5min，12000g离心收集上清，即为感染SGIV的GS细胞的特异核酸适配体库。
[0044] 3、PCR扩增筛选文库
[0045] 取200 yl筛选得到的感染SGIV的GS细胞的特异核酸适配体库进行PCR扩 增，具体的扩增条程序是：94°C 2min，94°C lmin