，60°C 30sec，72°C lmin，经过12轮循环， 72°C 5min。第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0046] 4、DNA单链文库的制备
[0047] 将100 y 1链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中PCR扩增所得的双链DNA在常温下 孵育30min，利用双链DNA上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到 磁珠表面，将EP管放在磁性分离器上除去上清，用lmLPBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入 400ul 200mM NaOH溶液，常温反应15min，利用磁性分离架回收得到上清；除盐柱用10mL无 菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完。加入lmL无菌水，收集到含有DNA 单链文库的溶液。
[0048] 5、如上反复筛选
[0049] 将步骤4中得到的DNA单链文库代替步骤（2)中的随机文库，重复步骤2-4所示 的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程14次。
[0050] 6、阴性筛选
[0051] 在第二轮及第二轮以后筛选中，用正常的GS细胞为对照，将步骤5后筛选得到的 DNA单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：培养GS细胞至铺满 培养瓶底，用15ml PBS洗涤细胞；将筛选得到的DNA文库溶解、95°C恒温水浴、冰浴后，与经 前述处理后的正常GS细胞在冰上孵育0. 5h，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液；然后将此 溶液与被SGIV感染的GS细胞进行冰浴结合lh ;将感染SGIV的GS细胞经85~94°C恒温 水浴加热2~10min，12000g离心收集到上清1后，再将此上清1与经前述处理后的另一瓶 正常GS细胞在冰上孵育lh，收集到的上清2即为经过两次反筛的高特异性识别感染SGIV 的GS细胞的核酸适配体。
[0052] 7、15 轮筛选
[0053] 将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的PCR扩增和步骤4的单链DNA文库 制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞术检测所得文 库对感染SGIV的GS细胞识别能力的增强情况，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选 过程中正常GS细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随 后的筛选过程中，文库与正常GS细胞结合时间从0.5h增加至lh，文库与病毒感染细胞结合 时间从lh缩短至0. 5h，以提高每轮的筛选效率，直至15轮筛选后，文库对被感染SGIV的 GS细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例的1条 可用于检测SGIV感染的核酸适配体，序列如SEQ ID NO :1所示。
[0054] 8、利用流式细胞术检测筛选过程中核酸适配体文库的富集情况
[0055] 将感染SGIV的GS细胞用无酶消化液处理，1000g离心除去上清，用5mLPBS离心洗 涤三次。将300nM异硫氰酸荧光素（FITC)标记的第9轮、10轮、11轮、12轮、13轮、14轮筛 选文库溶于lmL的binding buffer中，然后与经上述处理后的细胞在冰上孵育结合30min， 1000g离心去上清，用5mLPBS离心洗涤三次，最终将细胞混匀在500 y 1 PBS中，用于流式 细胞仪检测。以与Library结合的细胞为对照1，以各轮文库与正常GS细胞的结合为对照 2,检测结果如图1所示。该结果证实，经过14轮的筛选，得到的筛选文库对感染SGIV的GS 靶细胞具有较强的特异性识别能力（图1A)，而对正常的GS对照细胞无识别（图1B)。
[0056] 9、利用流式细胞术检测本实施例中四条异硫氰酸荧光素（FITC)标记的核酸适配 体对感染SGIV的GS细胞的结合效果及其特异性
[0057] 细胞的处理、细胞与核酸适配体的孵育结合过程如上述所示，流式细胞术的检测 结果如图2所示，结果证实，序列1的核酸适配体均对靶细胞感染SGIV的GS细胞具有较强 的特异性识别能力。
[0058] 10、荧光显微镜检测本实施例中四条羧基四甲基罗丹明（TAMRA)标记的核酸适配 体与感染SGIV的GS细胞的结合效果及其特异性
[0059] 在六孔板中的盖玻片上培养GS细胞，接入SGIV后继续培养48h，获得感染SGIV 的GS细胞细胞，在另一盖玻片上培养正常GS细胞作为对照，去除培养基，用10mL PBS洗 绦细胞。加入含有300nM上述本实施例中的核酸适配体的lmL binding buffer，冰浴结合 30min。反应结束后，去除上清，用10mL PBS清洗三次，略干燥后，将盖玻片放在载玻片上用 抗荧光淬灭剂封片，观察。如图3所示，序列1的核酸适配体均对感染SGIV的GS细胞具有 特异性结合能力，而对正常GS细胞几乎没有结合能力，该结果与流式细胞仪的检测结果一 致。
[0060] 11、核酸适配体对被虹彩病毒感染的石斑鱼肝脏组织的特异性结合测试
[0061] 用羧基四甲基罗丹明（TAMRA)标记的序列1核酸适配体，对感染SGIV的石斑鱼 肝脏组织冰冻切片进行特异性结合检测，将核酸适配体与正常石斑鱼肝脏组织冰冻切片的 结合结果作为对照。首先将冰冻切片用l〇〇mL PBS洗涤3次，将切片与200 y 1含有300nM TAMRA标记的核酸适配体的binding buffer室温孵育结合60min，然后将组织放在摇床上 用100mL PBS洗涤，对照正常组织的染色和洗涤方法相同。待组织略干燥后，用抗荧光淬灭 剂封片，在荧光显微镜下观察。如图4所示，序列1所示的核酸适配体均对感染SGIV的石斑 鱼肝脏组织具有较强的特异性结合能力，而对正常石斑鱼肝脏组织几乎没有结合能力。这 与感染SGIV的石斑鱼细胞的荧光显微镜观察结果和流式细胞仪检测结果一致。
【主权项】
1. 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示，所述的核苷酸序列上结合有用于检测的标记。
2. 根据权利要求1所述的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其特征在 于，其核苷酸序列上的任一位置能够被磷酸化、甲基化、氨基化、疏化或同位素化。
3. 根据权利要求1所述的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其特征在 于，所述的用于检测的标记为异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、生物素、地高辛、荧光物 质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
4. 权利要求1所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 、合成以下随机单链DNA文库和引物： 随机文库Library50 : 5 '-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC 5' 引物：5' -FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ； 5' 引物：5' -TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ； 3' 引物：5' -Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3' ； (2) Xell-SELEX筛选流程：用石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞，细胞 继续培养48h，去除培养基后用缓冲液洗涤被感染的GS细胞，将步骤（1)中的随机文库溶 解后首先与正常GS细胞在冰上孵育结合0. 5h得到上清，然后将上清与被感染的GS细胞进 行孵育结合lh，孵育完成后去除液体并用缓冲液洗涤GS细胞，然后将洗涤后的GS细胞于 85~94°C加热2~lOmin，离心得到上清1，将上清1与正常的GS细胞在冰上孵育结合，用 与得到上清1相同的方法得到上清2,即为被虹彩病毒感染的GS细胞的特异性核酸适配体 文库； (3) 、文库扩增：利用步骤（1)中的合成的引物对步骤（2)中筛选得到的特异性核酸适 配体文库进行PCR扩增，得到扩增产物双链DNA; (4) 、DNA单链文库的制备：将链酶亲和素标记的磁珠与步骤（3)中的双链DNA在常温 下孵育，利用双链DNA上的标记与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表 面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，将上清液通过除盐柱收集到含有DNA单链 文库的溶液； (5) 、重复多轮筛选：将步骤（4)中收集的DNA单链文库代替步骤（2)中的随机文库，重 复以上步骤（2)-(4)至少14次，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常GS 细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程 中，文库与正常GS细胞结合时间从0. 5h增加至lh，文库与病毒感染细胞结合时间从Ih缩 短至0. 5h，以提高每轮的筛选效率，即得到用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配 体。
5. 根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤（2)中所述的 培养基为L15培养基。
6. 根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤（2)中所述的 缓冲液为PBS缓冲液。
7. 根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤（3)中所述的 PCR扩增，其扩增体系为：1000yI:10Xbuffer100y1，dNTP(2. 5mM)80y1，模板 100y1， 5' 引物 30yl，3' 引物 30yl，rTaq酶 10yl，dsH20 650yl，扩增程序为：94°C2min， 94°Clmin，60°C30sec，72°Clmin，经过 12 轮循环，72°C5min。
8. -种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的试剂盒，其特征在于，含有权利要求I所述的 DNA核酸适配体。
9. 权利要求1所述的DNA核酸适配体在进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。在每轮筛选过程中，引入两次反筛的步骤，首先将前一轮的单链DNA文库与正常细胞结合，以去除与正常石斑鱼细胞结合的非特异ssDNA，然后将上清与被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞进行结合筛选，从被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞上分离得到的ssDNA，然后再和正常细胞结合，分离得到上清。PCR扩增文库制备出单链的DNA文库。重复以上的筛选流程，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70, C12N15-115
【公开号】CN104789696
【申请号】CN201510125764
【发明人】秦启伟, 李鹏飞, 魏世娜, 杨敏, 周伶俐, 俞也频
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月20日