一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒的制作方法
【专利说明】—种同时检测CSFV、PRRSV、PRV, PCV2的四色荧光定量PCR
方法及其试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该病传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主。感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业带来了重大的经济损失。病猪是本病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染和隐形感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰爆发的猪瘟也表明，猪瘟的流行形式在发生改变，这给全世界的养猪业带来了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(Bivineviral disease virus，BVDV)和羊边界病毒(border disease virus，BDV)同属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)，在进行抗原检测的时候，能发生交叉免疫反应，而针对基因设计特异的引物、探针，则可以有效地避免交叉检出。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3KB，含一个大的开放阅读框(0RF)，病毒粒子呈球形，直径40_50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。
[0003]猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是:眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。我国的PRRSV分离毒株大多属于基因2型，S卩北美型。而高致病性猪蓝耳病病毒，是指非结构蛋白2 (Nsp2)编码区连续缺失12个氨基酸的毒株，并对猪呈现致死性。
[0004]伪狂犬病(Pseudorabies，PR又名 Aujeszky’s disease, AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分尚出病毒。伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱瘆病毒I型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱瘆病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名。本病毒是疱瘆病毒中抵抗力较强的一种，在不同的液体中和物体表面至少存活7d。本病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感；在pH 4?9之间稳定；对热抵抗力较强。真空冷冻干燥的病毒培养物可保存多年。蛋白质序列表明，PRV与牛疱瘆病毒(BHV-1)、马疱瘆病毒(EHV-1)以及水痘病毒的同源性很高。目前，在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒(Bartha-K61)，在其基因组BamH 1_7片段中缺失了约4kb的序列，此序列包括整个gE ( g I)和大部分g K gp63)序列。而本专利以gC基因作为靶序列，设计出用于检测出伪狂犬病毒野毒株以及疫苗株的引物和探针。
[0005]猪圆环2型病毒已经遍及世界各养猪国家，成为全球性疫病之一。已有的研宄表明，PCV-2与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪的流产和繁殖障碍、猪增生性坏死性肺炎(PNP)和猪先天性脑震颤(CT)等的发生密切相关。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72°C的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1为非致病性的病毒。PCV-2为致病性的病毒，为单链DNA病毒。猪对PCV-2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。虽然PCV-2可分为多种基因型(PCV-2a，PCV-2b，PCV_2c，PCV_2d)，但各基因型之间核苷酸的同源性大于96%，而与PCV-1型的同源性小于80%，所以适合用荧光定量PCR的方式来区分PCV-2型和PCV-1型。
[0006]常规的猪瘟、猪蓝耳病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研宄，国外有学者分别对CSFV Alfort株和Brescia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株(shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、睾丸、附睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、□咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行了 PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，不仅可以检出病毒，还可以进行病毒的分型，以便结合症状进行更加有效的诊断。
[0007]概括来说猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存在特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。
[0008]荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了 “猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了 “一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒感染的联合检测方法还未完善。
[0009]多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测方法。
[0011]本发明的另一目的在于提供一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝