与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用
【专利说明】与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记 物及其应用 发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及分子遗传学领域，涉及与中国人群先天性巨结肠发生相关 的单核苷酸多态性标记物及其应用。
【背景技术】
[0002] 先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR，0MIM#142623)，又称肠无神经节细 胞症，是导致功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形，属典型肠神经系统先天发育异常 性疾病。主要病理特征是病变肠段肌间神经丛和粘膜下神经丛神经节细胞缺如伴神经纤 维增生，肠道神经调节紊乱，以致受累肠段持续异常收缩，近端结肠代偿性扩张、增厚，形成 巨结肠。主要临床表现是胎粪排出延迟或无胎粪排出，继发腹胀及肠梗阻。现已明确HSCR 是一种神经嵴细胞（Neural Crest Cell，NCC)源性疾病，发病与胚胎期NCC在肠道内的迀 移、增殖、分化、成熟异常有关。根据受累肠段的范围，本病可分为短段型（最常见，约占全 部HSCR的80% )、长段型（15% )及全结肠型（5% )三种。HSCR平均发病率为1/5,000， 存在明显种族差异：亚洲人群最高，为1.4/5, 000。我国属高发病率国家。目前我国统计活 产儿发病率约为1/3, 000,男性明显高于女性（约4 : 1)，即每年有近5500名新生儿会出 现该种出生缺陷，仅次于先天性肛门直肠畸形。新生儿患者因临床表现多样、发病轻重程度 不一、伴发症状各异，非常容易漏诊造成严重后果；虽然近年来外科治疗手段的不断改进使 得本病死亡率大大降低，但仍有很多患儿在治疗后出现一系列并发症，造成进一步处理困 难甚至是难以矫治的遗留问题，严重影响患儿健康，给社会和家庭带来了沉重的经济负担。
[0003] 新生儿HSCR的诊断相当困难，需要先结合其临床表现：不排胎便或胎便排出延迟 合并腹胀、肠梗阻、呕吐，直肠指检伴有气、便排出，才能考虑本病诊断。同时还需对患儿进 行一系列辅助检查，如：下消化道造影，24小时钡剂灌肠检查，肛门直肠测压及活检病理检 测等，这些辅助检查本身也存在一些缺陷，如检查价格昂贵、射线辐射危险、操作繁琐且有 一定的创伤性及风险。这都给患儿带来极大的痛苦并且给家庭带来沉重的经济负担。更 为重要的是，这类检查均基于不排胎便及胎便排出延迟等临床症状的发生，而出现此类症 状往往已在患病后数日常常错过了最佳的早期手术时机，并给患儿带来了相当长时间的痛 苦。另外一种临床常见情况是患儿病情严重凶险，为了及时缓解症状、挽救患儿生命，首诊 医院只能进行急诊回肠造瘘手术，术中未行病理检查病因不明，术后远端结肠形态改变往 往已不典型，给后续诊断和鉴别诊断带来很大困扰。综上所述，寻找一种简单、准确、微创的 早期HSCR诊断方法意义重大。
[0004] 目前虽然也有通过检测血浆中的miRNA标记物来对HSCR进行早期诊断和筛查的 方法，但是这种标记物诊断是通过测量血楽?中miRNA的数量变化进行的，而标记物数量的 测量结果和精度很容易受到检测方法和结果判读人员的主观影响，客观真实性不强。
[0005] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，即SNP)是在基因组水平上 由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种， 占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基 对中就有1个，鉴于其易于基因分型和适于快速、规模化筛查的特性，几十年来在遗传性疾 病乃至正常人类性状的研宄中都具有重要意义。并且，绝大多数单核苷酸多态性都是二等 位多态性，非此即彼，对这些标记物的检测结果不会受标记物浓度的影响，更具准确性和敏 感性。
[0006] 虽然近年来陆续有学者在对SNP和先天性巨结肠发生的相关性进行研宄，也发现 了一些先天性巨结肠的相关基因。但是，由于SNP具有比较大的种族差异性，到目前为止， 一直尚未有明确的专门针对中国人群HSCR疾病进行早期诊断筛查的SNP或SNP组合报道， 尤其是尚未发现有稳定的、特异的、敏感的与中国人群HSCR发病相关的SNP标记物。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物， 其选自 rs2435357、rs2506030 或 rsl2707682 中的一种。其中，
[0008] rs2435357的序列为SEQ ID No. 1所示的序列：
[0009] GCCAAGGGGGCCAGTGACCCTTACACGGTCATCCACAGGCCACTTGGGTGG,
[0010] 其中26位核苷酸为SNP位点，参考核苷酸为C，变异核苷酸为T。
[0011] rs2506030的序列为SEQ ID No. 2所示的序列：
[0012] AAAATAGAATCGACACCAATGACCTATTCCAGTCTCCCCTCCCGACTGCAG,
[0013] 其中26位核苷酸为SNP位点，参考核苷酸为A，变异核苷酸为G。
[0014] rsl2707682的序列为SEQ ID No. 3所示的序列：
[0015] AATTAGGAGAAACATTTCCATTGACCTAGTACCATCACTACCACTGTTGAT,
[0016] 其中26位核苷酸为SNP位点，参考核苷酸为C，变异核苷酸为T。
[0017] 优选的，本发明所述的与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记 物为 rs2435357、rs2506030、rsl2707682 中任意二个的组合。
[0018] 优选的，本发明所述的与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记 物为 rs2435357、rs2506030 和 rsl2707682 的组合。
[0019] 本发明还提供了一种上述单核苷酸多态性标记物的引物，其中rs2435357的上游 引物为SEQ ID No. 4,下游引物为SEQ ID No. 5;rs2506030的上游引物为SEQ ID No. 6,下 游引物为SEQ ID No. 7 ;rsl2707682的上游引物为SEQ ID No. 8,下游引物为SEQ ID No. 9。
【主权项】
1. 一种与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物，其选自 rs2435357、rs2506030 或rsl2707682 中的一种；其中， 所述rs2435357的序列如SEQIDNo. 1所示： GCCAAGGGGGCCAGTGACCCTTACACGGTCATCCACAGGCCACTTGGGTGG； 所述rs2506030的序列如SEQIDNo. 2所示： AAAATAGAATCGACACCAATGACCTATTCCAGTCTCCCCTCCCGACTGCAG； 所述rsl2707682的序列如SEQIDNo. 3所示： AATTAGGAGAAACATTTCCATTGACCTAGTACCATCACTACCACTGTTGAT。
2. 根据权利要求1所述的单核苷酸多态性标记物，其选自rs2435357、rs2506030、 rsl2707682中任意二个的组合。
3. 根据权利要求1所述的单核苷酸多态性标记物，其选自rs2435357、rs2506030、 rsl2707682 的组合。
4. 权利要求1-3中任一所述的单核苷酸多态性标记物的引物。
5. 根据权利要求4所述的单核苷酸多态性标记物的引物，其中rs2435357的上游引物 为SEQIDNo. 4所示，下游引物为SEQIDNo. 5所示；rs2506030的上游引物为SEQIDNo. 6 所示，下游引物为SEQIDNo. 7所示；rsl2707682的上游引物为SEQIDNo. 8所示，下游引 物为SEQIDNo. 9所示。
6. 权利要求1-3中任一所述的单核苷酸多态性标记物在制备中国人群先天性巨结肠 的诊断筛查试剂中的应用。
7. 权利要求4所述的单核苷酸多态性标记物的引物在制备中国人群先天性巨结肠的 诊断筛查试剂中的应用。
8. -种用于对中国人群先天性巨结肠进行诊断筛查的试剂盒，其包含权利要求4所述 的单核苷酸多态性标记物的引物。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述引物选自SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5， SEQIDNo. 6 和SEQIDNo. 7,SEQIDNo. 8 和SEQIDNo. 9 中的一对或多对。
【专利摘要】本发明属于基因工程及分子遗传学领域，涉及与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用。本发明的单核苷酸多态性标记物对中国人群先天性巨结肠具有特异性和敏感性，可用于制备婴幼儿(或儿童)先天性巨结肠诊断或筛查的试剂，有效避免侵入性检查，可在症状出现前进行早期筛查和诊断，并可通过检测患儿父母DNA判断疾病来源，评估再次生育的患病风险。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104789688
【申请号】CN201510237073
【发明人】姜茜, 李颀, 张震, 肖萍, 苏琳, 甘亮, 上官少方, 李龙
【申请人】首都儿科研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月12日