山羊atbf1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物分子育种领域，涉及重要功能基因单核苷酸多态性（SNP)的检测 方法及其应用，特别涉及山羊ATBFl基因单核苷酸多态性的检测方法及其在育种中的应 用。
【背景技术】
[0002] 动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态 为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择 (marker-assisted selection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析 DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状 选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水 平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的 亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种 目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及 提高回交育种效率等方面具有优越性。
[0003] 在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分 析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择（MS)技术 应用的前提和关键。作为第三代分子遗传标记，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)是一种新型分子标记。SNP是指DNA序列上单个核苷酸（A/T/C/G) 的变异而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。一 般而言，SNP是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异，这种变异包括碱基的替换、插入、缺失 以及重复序列拷贝数的变化。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式， 但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2: USNP在CG序列上出现最为频繁， 而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。在人 类基因组中，每隔100至300个碱基就会存在一处SNP位点。每3个SNP位点中有2个会 是C和T的相互转变。人类遗传基因的各种差异，90%可归因于SNP引起的基因变异。由 于同一位点的不同等位基因之间经常只有一个或几个核苷酸的差异，利用SNP分析个体基 因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对单个核苷酸的差异进行SNP检 测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。
[0004] 目前，SNP根据其在基因组中的位置，可以分为基因编码区SNPs(Coding-region SNPs，cSNPs)、基因周边区 SNPs(Perigenic SNPs，pSNPs)和基因间隔区 SNPs(Intergenic SNPs，iSNPs)。由于密码子的简并性，处于编码序列的SNP不一定会改变蛋白质的氨基酸序 列。所以，编码区的SNP有两种类型：同义突变和错义突变。同义突变并不影响蛋白质序 列，但有研宄显示同义突变会影响目的蛋白质的翻译效率，进而对基因功能产生重要影响； 错义突变则会改变蛋白质的氨基酸序列，最终影响到蛋白质的功能。不在蛋白质编码区的 SNP仍可能影响转录子的结合、基因剪接、信使RNA降解或非编码区的RNA序列，所以，在群 体遗传研宄中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研宄中也具有重要意义。 因此，SNP在遗传病和育种的研宄中具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。
[0005] 迄今为止，检测SNPs的技术非常多，包括限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)、单构链多态性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、直接测序法、新 型高通量SNP检测技术和引入突变位点的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在这些技 术中，PCR-RFLP法是最早应用于分子人类学的SNP检测技术，因为该技术简单且易操作， 对于检测单拷贝上（线粒体和Y染色体）的SNP，准确度非常高，但由于PCR-RFLP分析受 到特定的自然酶切位点的限制，故在实际应用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技术简便、 快速、灵敏，但最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序，且电泳条件要求较严格，故多 用于DNA研宄中的未知基因突变的检测和临床实验；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检 测方法，简单且花费较小，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是该方法需要设 计特别的引物，两个反应才能得到一个SNP位点的分型，且只能针对特定的基因位点，同 时由于两个等位基因特异性引物只有末端碱基不同，有时候可能会出现错误的扩增，从而 产生误检；直接测序法是最为准确的SNP检测方法，但其检测费用极其昂贵，且需要有测 序仪等大型仪器，还需要非常熟练的技术人员和经验，故对于在一段很短的序列上存在多 个SNP的检测是有优势的，但不适用于生产实际；新型高通量SNP检测技术，如SNP芯片、 GWAS和第二代测序等对于样本量较小的实验研宄，成本过高，在生产实际中应用较为局限； Forced-PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，与通常的PCR-RFLP分析原理相同，即在 发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，进 而鉴别SNP位点，同时Forced-PCR-RFLP可以通过设计错配引物，进行定点突变，从而产生 新的酶切位点，克服了通常的PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位点的限制。总之，由于 PCR-RFLP技术和Forced-PCR-RFLP方法的联合，不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费 用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求，因此，PCR-RFLP 和Forced-PCR-RFLP方法在育种工作中的受到青睐，在动物分子育种的MS体系中具有广 阔应用前景。
[0006] 我国是传统的养羊大国，也是目前世界上羊存栏数最多的国家。随着经济发展和 人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但由于近年来羊肉、羊奶等羊产品 严重短缺，所以山羊育种专家期望尽快培育出山羊产品的优良品种。在高产、优质和高效的 山羊育种目标上，山羊育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还 需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与山羊生长发育性状密切相关的 DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分 析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。
[0007] AT模体结合因子I (AT motif-binding factor，ATBF1)起初是作为与人类K-甲胎 蛋白（AFP)基因的增强子中AT富含元件结合的蛋白被分离的，可与甲胎蛋白基因的增强子 中AT富含元件结合，抑制AFP基因的转录，是目前发现的分子量最大的反式作用因子。人 ATBFl基因定位于染色体16q22. 3_q23. 1，通过选择性剪接产生ATBFl-A和ATBFl-B两种转 录本。其中，ATBFl-A是ATBFl基因全长的mRNA转录本所表达的蛋白质，也是ATBFl基因 存在的主要形式，编码404kD蛋白，3703个氨基酸，氨基酸序列中有4个同源结构域和23个 锌指结构，在这23个锌指结构中包括1个假锌指结构模序；ATBFl-B是由于在转录过程中， mRNA的剪接加工，使第1外显子和第4外显子连接所表达的蛋白质，与ATBFl-A相比，在N 端缺少920个氨基酸和5个锌指结构。
[0008] ATBFl不同的异构体具有不同的调节作用。ATBFl-A能抑制AFP基因的增强子，可 诱导细胞分化和凋亡；而ATBFl-B则能激活AFP的启动子和增强子，促进AFP的表达。目 前，ATBFl作为一个新的抑癌基因而被广泛关注，主要集中在ATBFl异构体的选择性表达及 其调控机制上。有研宄表明，ATBFl在成体器官中都有表达，ATBFl的异常表达与很多人类 的慢性疾病有关。而且，ATBFl用于修复组织和保护细胞氧化应激。已有研宄表明，ATBFl 可与PIAS3相互作用抑制STAT3介导的信号转导，而STAT3在胚胎早期发育、细胞分化、后 哺乳期乳腺的发育等方面具有很重要的作用。Cha-Gyun Jung等（2005)揭示了 ATBFl可 使细胞周期停滞，诱导神经细胞分化。Yingchuan Qi等（2007)揭示，垂体特异性转录因子 I(PIT-I)的早期激活需ATBFl的参与，ATBFl是一种新的垂体调节因子。众所周知，PIT-I 基因在动物生长发育中发挥重要的调节作用，能调控生长激素（GH)和催乳素（PRL)基因的 表达，对动物泌乳和生长发育具有显著遗传效应。由此可见，ATBFl对形成胚胎、调控生长 激素和催乳素等具有重要的作用，故研宄中国地方羊ATBFl基因的遗传变异和分子遗传特 征具有重要的理论和实践意义。
[0009] 目前，对ATBF1基因的研宄主要集中在与癌症相关方面的研宄上，对中国地方山 羊ATBFl基因遗传变异领域的研宄匮乏，该基因位点的功能研宄更是空白。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种山羊ATBFl基因单核苷酸多态性的检测方法及其应 用，从而加快良种选育速度。
[0011] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0012] 一种山羊ATBFl基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
[0013] 以包含ATBF1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR 扩增山羊ATBFl基因，用限制性内切酶MspI酶切扩增产物，然后对酶切后的扩增产物片段 进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBFl基因第25748位的单核苷 酸多态性；所述引物对Pl为：
[0014] 上游引物：5' GCAAGAAGTGGGTGATCCAGACTGTTTCCC 3'（如 SEQ. ID. NO. 1 所示）
[0015] 下游引物：5' TCGCACCATCAAAGACAAC 3'（如 SEQ. ID. NO. 2 所示）
[0016] 或者，
[0017] 以包含ATBFl基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，通过PCR 扩增山羊ATBFl基因，用限制性内切酶HpaII酶切扩增产物，然后对酶切后的扩增产物片段 进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBFl基因第163517位的单核苷 酸多态性；所述引物对P2为：
[0018] 上游引物：5' GACTCTTACCCAGCACGTACCCT 3'（如 SEQ. ID. NO. 3 所示）
[0019] 下游引物：5' TAACAGAAACCCACCATCCACAA 3'（如 SEQ. ID. NO. 4