一种利用荧光探针检测dna单核苷酸多态性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种DNA单核苷酸多态性的检测方法。本发明提供的方法是用荧光物质标记待测样本的DNA，通过所述荧光物质与水溶性共轭聚合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸。本发明处理简便，省略了各种分离、纯化步骤，利用少量DNA就能够检测到单核苷酸多态位点的核苷酸。
【专利说明】—种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测DNA单核苷酸多态性的方法，特别涉及一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
[0003]单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，有90%都可归因于SNP所引起的基因变异。在人基因组中，每隔100至300个碱基就会存在一处SNP。基因组DNA中单核苷酸多态性的分析和测定可用来绘制基因图谱、进行基因联合研究等。
[0004]单核苷酸多态性是第三代遗传诊断标记，近几年被广泛应用于生物以及医学研究的诸多领域，分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如=DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，但上述方法对样品处理的要求较高，需要进行繁琐的分离或洗涤的程序，增加了样品的损失以及检测的时间。为了避免上诉问题，目前常采用一种均相免疫检测的方法，该方法基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，但偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高，除此之外，基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。因此，设计出一种更为灵敏、有效的单核苷酸多态性检测方法是极为迫切的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种克服上述缺点，高效、灵敏、简便、快速、无需分离的利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。
[0006]实现本发明目的的技术方案是:一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，依次包括以下步骤:
[0007]I)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA ；
[0008]2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱有较好的重叠，光谱重叠积分范围为8.0X 10_16~5.0X 10_13 M'm3。
【权利要求】
1.一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:依次包括以下步骤: 1)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA； 2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱有较好的重叠，光谱重叠积分范围为8.0X 10-16~5.0X 1(T13 IVT1CnA
2.如权利要求1所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述式(I)中，R为6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戍基、4-二甲胺基丁基、4-二乙胺基丁基、3-二甲胺基丙基和3-二乙胺基丙基中的任意一种。
3.如权利要求1所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述式(I)中，X为氯、溴和碘中的任意一种。
4.如权利要求1至3中任一所述的一种突光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述用荧光物质标记步骤I)的DNA的方法为:用荧光物质标记的dNTP或ddNTP对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。
5.如权利要求4所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述单碱基延伸中，所用的引物有两种:野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与目标单核苷酸多态位点相邻20-25bp的序列互补。
6.如权利要求5所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为:若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
7.如权利要求1至3中任一所述的一种突光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述用荧光物质标记步骤I)的DNA的方法为:用荧光物质A标记与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补的dNTP或ddNTP，用荧光物质B标记与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸的互补dNTP或ddNTP，用所述荧光物质A标记的dNTP或ddNTP和荧光物质B标记的dNTP或ddNTP同时对PCR扩增产物进行单碱基延伸；在同一激发光的作用下，所述荧光物质A和所述荧光物质B产生的荧光的波长至少相差50nm。
8.如权利要求7所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:所述单碱基延伸中，所用的引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻(上游或下游)20-25bp的序列互补。
9.如权利要求8所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于:确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为:若单独出现PCP到荧光物质A的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若单独出现PCP到荧光物质B的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若两种荧光共振能量转移都出现，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
10.如权利要 求6中任一所述的一种突光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法,其特征在于:所述荧光物质为荧光素、罗丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。
【文档编号】C12Q1/68GK104031979SQ201310071889
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】王树 申请人:常州欣宏科生物化学有限公司