一种cyp2c19*2和cyp2c19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA?2G封闭CYP2C19*2位点处的G等位基因，PNA?2A封闭CYP2C19*2位点处的A等位基因，PNA?3G封闭CYP2C19*3位点处的G等位基因，PNA?3A封闭CYP2C19*3位点处的A等位基因，从而使得相应的LAMP反应无法继续，以此达到检测CYP2C19基因型的目的。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉，利于临床检验大范围普及。
【专利说明】
-种CYP2C19巧和CYP2C19巧多态性检测的引物组合物、试剂 盒及方法
技术领域
[0001 ] 本发明属于生物检测技术领域，尤其是设及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检 测的引物组合物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 在人体中，CYP2C19参与氯化格雷、S-美芬妥英、奥美拉挫、伏立康挫、安定、去甲安 定等药物的代谢。氯化格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血 栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。屯、脏支架手术后的患者需长期服 用氯化格雷W防止支架内再梗。氯化格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。 CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者（ultrarapid metabolizer，UM)、快代谢者（extensive metaboIizer，EM)、中间代谢者（intermediate metabolize;r，IM)和慢代谢者（poormetabolize;r，PM)4种表型。CYP2C19巧（rs4244285， C. 681G〉A)和CYP2C19*3(rs4986893，c. 636G〉A)是中国人群中存在的巧中导致CYP2C19酶缺 陷的主要等位基因。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3 杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。 CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯化格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作 用下降。美国FDA和美国屯、脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗 方案。阿米替林为=环类抗抑郁药，主要用于焦虑性或激动性抑郁症的治疗。阿米替林在体 内主要经CYP2C19代谢为活性代谢产物去甲替林。CYP2C19活性的高低可通过影响血液中阿 米替林与去甲替林的浓度比，影响阿米替林的疗效和不良反应的产生。伏立康挫是一种广 谱S挫类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C1犯M与PM个体间伏立康挫的血液 浓度存在显著差异，PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量； EM和IM个体可给予常规剂量。在常规剂量治疗时，若EM个体出现毒副反应或PM疗效不佳，均 应考虑更换药物。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康挫前需检测CYP2C19基因型，W 确保用药安全。由上述可见，CYP2C19的活性在在临床指导用药上具有非常广泛的作用，因 此，CYP2C19巧和CYP2C19*3的检测也是非常重要。目前用于检测运两种亚型的方法主要是 直接测序法、Taqman巧光PCR法W及忍片法等等，运些方法均在不同方面展现出了自己的优 势，但是也都普遍存在检测仪器及配套试剂耗材购买成本高昂，检测周期长、操作繁琐且假 阳性率时有出现的问题。因此，发明并构建一套价格低廉，使用操作简便且利于临床检验大 范围普及的商品化试剂盒就显得十分重要。
[0003] 日本科学家于2000年提出一种恒溫扩增法-----环介导等溫扩增技术化〇〇口- Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，该技术的主要特点是针对勒1基因的6个区域 设计4条引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的催化下于65°C左右进行恒溫扩 增，仅需15-90分钟即可获得IO9-IOW数量级的特异产物。具有操作简单，特异性强和成本低 廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法 进行基因突变的检测也偶见报道，但运些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很 不稳定，因此在市场上还没有W LAMP法为基础的基因突变检测试剂盒出售。肤核酸(PNA)是 具有类多肤骨架的DNA类似物，骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基幾 基连接而成的。PNA可W特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PNA与祀序列完全 互补时，运种复合体的稳定性要远远高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。 然而，当PNA与祀序列不完全配对甚至只有一个碱基错配的时候，运种PNA-DNA复合物就变 得非常不稳定，很容易打开双链。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是现有CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测存在费用高，检测 周期较长、操作繁琐且假阳性率时有出现等问题。
[0005] 为解决上述问题，本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用 PNA-2G封闭CYP2C19*2位点处的G等位基因，PNA-2A封闭CYP2C19*2位点处的A等位基因， PNA-3G封闭CYP2C19*3位点处的G等位基因，PNA-3A封闭CYP2C19*3位点处的A等位基因，从 而使得相应的LAMP反应无法继续，W此达到检测CYP2C19基因型的目的。该方法既快速灵敏 又成本低廉，利于临床检验大范围普及。
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组 合物，包括如下八条引物和四条肤核酸序列：
[0007] 5'-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（沈Q ID No.l，W下简称F3);
[000引 5'-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3'（沈Q ID 齡.2，^下简称83);
[0009] 5 '-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAA TGC-3'（SEQ ID 齡.3，^下简称。1口）；
[0010] 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（沈Q ID 齡.4，^下简称81口）；
[0011] 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（沈Q ID No. 5，W下简称F3');
[0012] 5'-4166口'61'口'466〔4464-3'（沈9 10齡.6，^下简称83');
[0013] 日 '-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（沈Q ID No.7，W 下简称FIP/ );
[0014] 5 '-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（沈Q ID No.8， W下简称BIP'); W及
[0015] 用于封闭CYP2C19巧位点处G等位基因的肤核酸序列：
[0016] 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（沈Q ID 齡.9，^下简称？臟-26);
[0017] 用于封闭CYP2C19巧位点处A等位基因的肤核酸序列：
[001 引 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（沈Q ID 齡.10，^下简称口臟-2八）；
[0019] 用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肤核酸序列：
[0020] 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID 齡.11，^下简称?臟-36);
[0021] 用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肤核酸序列：
[0022] 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 齡.12，^下简称?臟-3八）；
[0023] 其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3'、B3'、FIP'和BIP'为检测 CYP2C19*3的引物。
[0024] 本发明的第二个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒， 所述检测的试剂盒包括上述的引物和肤核酸序列。
[0025] 进一步地，所述检测的试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bs t聚合酶和超纯水。
[00%] 进一步地，所述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系 2G，检测CYP2C19*2位点处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反 应体系3G，检测CYP2C19*3位点处A等位基因的反应体系3A:
[0027] 反应体系2G中包括。3、83^1?、81?、？臟-26、(1饥1\缓冲液、831聚合酶和超纯水；
[0028] 反应体系2A中包括。3、83^1?、81?、？臟-24、(1饥1\缓冲液、831聚合酶和超纯水；
[0029] 反应体系3G中包括F3'、B3'、FIP'、BIP'、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯 水；
[0030] 反应体系3A中包括F3'、B3'、FIP'、BIP'、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯 水。
[0031] 进一步地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括用于显示体系颜色的指示剂。
[0032] 优选地，所述指示剂为径基糞酪蓝。
[0033] 优选地，所述指示剂在反应体系2G、2A、3G和3A中的浓度相同，径基糞酪蓝的浓度 为 120iiM。
[0034] 进一步地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应 体系中的浓度一致。
[0035] 优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。
[0036] 优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (体积分数）。
[0037] 优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3'和B3'的浓度相同，均为0.4iiM; FIP、BIP、FIP/和BIP/的浓度相同，均为1.6測，所述反应体系2G、2A、3G和3A中相应肤核酸序 列的浓度相同，均为0.化M。
[003引优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;所述反应体 系2G、2A、3G和3A中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。
[0039] 本发明的第S个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其 使用上述检测的试剂盒，包括如下步骤：
[0040] (1)抽取静脉血，抛DTA抗凝管保存；
[0041] (2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的模板，W超纯水代替模板做阴 性对照；
[0042] (3)采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体 系2G、2A、3G和3A中，于60°C下反应，然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后自然 降溫，观察体系颜色变化。
[0043] 进一步地，所述反应时间为60~SOmin。
[0044] 在本发明的四个反应体系中，当反应体系中存在指示剂时，选用径基糞酪蓝作为 指示剂时，反应前体系中的儀离子与dNTP馨合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，儀离 子与副产物焦憐酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观 察反应体系颜色的变化就可W直接判定是否发生扩增反应。
[0045] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0046] 本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基 因"封闭"，从而使得LAMP反应无法继续;而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因 时，PNA由于不能有效对其进行"封闭"，使得LAMP反应得W顺利进行，W此达到检测CYP2C19 基因型的目的。
[0047] 与现有技术相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：
[0048] (1)步骤简单:LAMP法本身对模板的要求并不严格，反应体系配置完毕后放置在恒 溫水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的 反复变性、退火、延伸等变溫过程；
[0049] (2)高特异性:扩增的特异性很高，可W根据是否扩增就能判断目标基因的存在与 否；
[0050] (3)扩增反应快速、高效:整个扩增化内即可完成，且产率高；
[0051] (4)鉴定简便:反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可W 脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；
[0052] (5)成本低廉:整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。
【附图说明】
[0053] 图1-图4分别是检测样本M1-M4用PCR测序分型得到的测序图谱；
[0054] 图5-图8分别是检测样本M6-M9用PCR巧膊分型得到的测序图谱。
【具体实施方式】
[0055] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但 不限定本发明的保护范围。
[0化6] -种CYP2C19巧和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物，包括如下八条引物和四条 肤核酸序列：
[0化7] 5'-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（沈Q ID No.l，W下简称F3);
[0化引 5'-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3'（沈Q ID 齡.2，^下简称83);
[0059] 5 '-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAA TGC-3'（SEQ ID 齡.3，^下简称。1口）；
[0060] 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（沈Q ID 齡.4，^下简称81口）；
[0061 ] 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（沈Q ID No. 5，W下简称F3');
[0062] 5'-4166口'61'口'466〔4464-3'（沈9 10齡.6，^下简称83');
[0063] 日 '-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（沈Q ID No.7，W 下简称FIP/ );
[0064] 5 '-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（沈Q ID No.8， W下简称BIP'); W及
[0065] 用于封闭CYP2C19巧位点处G等位基因的肤核酸序列：
[0066] 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（沈Q ID 齡.9，^下简称？臟-26);
[0067] 用于封闭CYP2C19巧位点处A等位基因的肤核酸序列：
[006引 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（沈Q ID 齡.10，^下简称口臟-2八）；
[0069] 用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肤核酸序列：
[0070] 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID 齡.11，^下简称?臟-36);
[0071] 用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肤核酸序列：
[0072] 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 齡.12，^下简称?臟-3八）；
[0073] 其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3'、B3'、FIP'和BIP'为检测 CYP2C19*3的引物。
[0074] 一种CYP2C19巧和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，所述检测的试剂盒包括上述的 引物和肤核酸序列，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱。
[0075] 所述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系2G，检测 CYP2C19*2位点处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反应体系3G 和检测CYP2C19*3位点处A等位基因的反应体系3A。反应体系2G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱;反应体系2A中包括F3、B3、FIP、 BIP、PNA-2A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、?基糞酪蓝和甜菜碱;反应体系3G中包括 F3/、B3/、FIP/、BIP/、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱;反应 体系3A中包括F3/、B3/、FIP/、BIP/、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝 和甜菜碱。
[0076] 四个反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置，作为一种实施方 案，四个反应体系中：F3、B3、F3/和B3/的浓度相同，均为0.化M;FIP、BIP、FIp/和BIp/的浓度 相同，均为1.6咖，相应肤核酸序列的浓度相同，均为0.4iiM; dNTP的浓度相同，均为1.4mM; Bst聚合酶的浓度相同，均为8U;缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HC120mM，KCl 50mM， (NH4)2S04 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (体积分数）；?基糞酪蓝的浓度相同，均为120 咖;甜菜碱的浓度相同，均为0.8M。
[0077] 一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其使用上述检测的试剂盒，包括 如下步骤:抽取静脉血，W邸TA抗凝管保存；用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的 模板，W超纯水代替模板做阴性对照;采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和 超纯水分别加入到反应体系2G、2A、3G和3A中，于60°C下反应，然后升溫至80°C保持20min进 行酶灭活处理，之后自然降溫，观察体系颜色变化。优选地，所述反应时间为60~80min。
[0078] 具体实施时，抽取8个人Iml静脉血W抓TA抗凝管保存，分为两组，一组用于检测 CYP2C19*2，记为Ml，M2，M3和M4，另有一 W超纯水代替模板的阴性对照，记为M5;另一组用于 检测CYP2C19*3,记为M6，M7，M8和M9,另有一 W超纯水代替模板的阴性对照，记为M10。每管 取200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组 DNA作为检测的模板。对模板Mn (n为组别编号，n为1-10)进行LAMP反应，将模板Ml -M5分别加 入到反应体系2G和2A中，将模板M6-M10分别加入到反应体系3G和3A中，各反应体系于60°C 下反应60min，然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后自然降溫，观察体系颜色变 化。
[0079] 利用检测试剂盒对模板Mn进行检测，作为一种实施方式，检测试剂盒的四个反应
[0081] 体系各为2如L，其内的组分和含量如下表1-表4所示：[0080] 表1反应体系2G的组分和含量
[0083] 表2反应体系2A的组分和含量
[0082]
[0084]
[008日]表3反应体系3G的组分和含量
[0086]
[0087] [008引
[0089]
[0090] 反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别 反应体系的颜色及基因型判断如下表5-6所示：
[0091] 表5 CYP2C19巧各组别反应体系的颜色及基因型判断
[0095] 为进一步验证反应的准确性，将上述8个实验组别的模板M1-M4、M6-M9分别用PCR 测序法进行分型，得到的测序图谱参见图1-图8。
[0092]
[0093]
[0094]
[0096] 对比基因测序图谱和本发明提供的检测的试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻 合率100 %，验证了本发明的结果精确。
[0097] W上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物，其特征在于:包括如下八条 引物和四条肽核酸序列： 5'-AGITTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（SEQ ID No.l，以下简称F3); 5 ' -TGATGTCCATCGATTCTTGG-3 '（SEQ ID No · 2，以下简称B3); 5'-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGC-3'（SEQ ID Νο·3,以下简称FIP); 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（SEQ ID No.4,以下简称BIP); 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（SEQ ID No · 5，以下简称F3'); 5 ' -ATGGCTGTCTAGGCAAGA-3 '（SEQ ID No · 6，以下简称B3'); 5 ' -GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（ SEQ ID No · 7，以下简 称FIP'); 5 ' -ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（ SEQ ID No · 8，以下 简称BIP"；以及 用于封闭CYP2C19*2位点处G等位基因的肽核酸序列： 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（SEQ ID Νο·9,以下简称PNA-2G); 用于封闭CYP2C19*2位点处Α等位基因的肽核酸序列： 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（SEQ ID 吣.10，以下简称卩熟-2八）； 用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肽核酸序列： 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID No.ll，以下简称PNA-3G); 用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肽核酸序列： 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 吣.12，以下简称卩熟-3八）； 其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3'、B3' AIP'和BIP'为检测CYP2C19* 3的引物。2. -种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述 的引物和肽核酸序列。3. 根据权利要求2所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:还 包括dNTP、缓冲液、Bs t聚合酶和超纯水。4. 根据权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系2G，检测CYP2C19*2位点 处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反应体系3G，检测CYP2C19* 3位点处A等位基因的反应体系3A: 反应体系2G中包括?3、83、？1?、81?、？熟-26、(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水； 反应体系2A中包括?3、83、？1?、81?、？熟-24、(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水； 反应体系3G中包括F3' JIP' 3IP'、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水； 反应体系3A中包括F3' JIP' 3IP'、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。5. 根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括用于显示体系颜色的指示剂。6. 根据权利要求5所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述指示剂为羟基萘酚蓝。7. 根据权利要求6所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述指示剂在反应体系2G、2A、3G和3A中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μΜ。8. 根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应体系中的浓度一致。9. 根据权利要求8所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于:所 述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为〇. 8M。10. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其 特征在于:所述反应体系2G、2A、3G和3A中缓冲液的浓度相同，均包括:Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (体积分数）。11. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其 特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3lPB3l勺浓度相同，均为0.4yM;FIP、 BIPJIP'和BIP'的浓度相同，均为1.6μΜ;所述反应体系2G、2A、3G和3A中相应肽核酸序列的 浓度相同，均为〇.4μΜ。12. 根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其 特征在于:所述反应体系2G、2A、3G和3A中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;所述反应体系2G、 2A、3G和3A中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。13. -种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，使用权利要求3-12任一所述的检 测的试剂盒，其特征在于:包括如下步骤： (1) 抽取静脉血，以Η)ΤΑ抗凝管保存； (2) 用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的模板，同时以超纯水代替模板做阴 性对照； (3) 采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系 2G、2A、3G和3A中，于60°C下反应，然后升温至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后自然降 温，观察体系颜色变化。14. 根据权利要求13所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其特征在于:所 述反应时间为60~80min。
【文档编号】C12N15/11GK105861690SQ201610299069
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】汪大为, 张井存
【申请人】北京晋祺生物科技有限公司