专利名称：一种对虾养殖水体菌群多态性检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾养殖水体微生物菌群多态性的分子检测方法，属于微生物生态学领域。
背景技术：
微生物在许多国民经济生产部门中具有重要地位，如生物医学工程(动物、人体保健)、生物农药(植物内生菌)、轻工业和环境保护、水产养殖等领域都利用微生物进行生产活动。多数情况下，这些部门的生产活动依赖的是多种微生物所组成的微生物菌群整体功能。长期以来，这些利用微生物生态系统进行生产活动的许多行业部门，由于受到传统微生物分离培养技术的限制，无法全面、客观地认识系统中的群落成员，更无法动态跟踪系统成员种群数量变化对系统功能的影响，生产效率低，而且不稳定。
水产养殖生态系统也是与微生物菌群有着密切联系，水中微生物的生态情况直接影响水产养殖业的发展，包括对鱼虾等疾病防治及其生长发育的影响。近年，国内外在水产养殖中对水的生态环境，特别是微生物生态环境和水生动物(鱼虾等)体的微生物情况(微生态环境)，因致病性细菌和病毒等引起鱼虾等疾病的流行，而受到重视。但是多侧重于有害微生物研究，特别是病原菌的研究，并且传统的分离菌种方法有其局限性，只有一部分能被培养，进行微生物多样性分析时其结果往往是局限的，不能准确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件较苛刻或许多不可培养微生物都无法预知，因此用传统培养方法所得到的调查结果不能准确反应微生物菌群的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法进行微生物菌群结构研究是必要。
近年，随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、核酸测序等的发展，微生物学研究领域发生了深刻的变革，灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能。借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段。上世纪80年代末至90年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物菌群结构分析，且发展迅速，研究热点主要集中于具有保守序列的16S rRNA上。研究方法包括分子杂交法、PCR法、SSCP法、DGGE法、RFLP和克隆文库法等，具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比有明显的优越性，推动了微生物菌群结构研究的快速发展。但是，这些基于PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所得到信息的精确度，并且实际工作中，用单一的分子生态学方法并不能完全达到预期的目的，并且每一种方法都有自身的不足，常常要结合运用多种分子生态学方法，有时甚至要结合传统方法，才能够对复杂环境的微生态系统进行全面的分析。
微生物生态学和微生态学研究结果，使人们认识到水体中有益微生物对改善水质、防治鱼虾疾病和提高产量有着重要作用。Susan E，Pryde，Anyhony J.Richardson，Colin S.Stewart，and Harry J.Flint.1999.Molecular Anyalysia of the Microbial Diversity Present in the Colonic Wall，Colonic Lumen，and Cecal Lumen of a Pig.Appl.Environ.Microbiol，655372-5377用于微生物菌群结构分析的基因组DNA信息包括16SrDNA(核糖体小亚基基因)，包含了相应细菌种类的系统分类地位信息，以16S rDNA为对象可以准确地分析微生物菌群的结构组成。一种常用的就是构建基因文库，通过分析一定数量的克隆子的序列以及它们的出现频率，可以在一定程度上了解环境样品中的主要菌群及其出现丰度等种群结构信息。但这种方法需要进行克隆、测序等水平的工作，耗费人力、财力和时间都较大，难以用于实际生产需要。另外，又发现了常用的依赖16S rDNA-DGGE技术Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complexmicrobial population by denaturing gradient gel electrophoresia analysis of polymerase chainreaction-amplified genes encoding for 16S rRNA..Applied Environmental Microbiology，1993，59(3)695-700。但这种分子检测方法一般只能分析500bp个碱基对以下的DNA片段，得到的系统进化相关信息很少，其图谱一般只有一二十个条带，系统中弱势菌不能被检测到，条件要求相对苛刻，DGGE电泳条件不一样，即使相同的样品所得到的图谱也有差异，到后期切割回收胶建立基因克隆文库，然后进行测序，因此也不是快捷，耗费人力、物力，并且当微生物种类过多时，同一条带可以包含多个种类的DNA信息，因此，不能做到在较高的分辨率下分析比较微生物菌群结构的差异。目前基于16S rRNA扩增的还有RFLP技术，从环境样品中提取总的DNA，用通用引物扩增16S rDNA，用各种限制性内切酶对扩增产物进行酶切分析，由于不同的菌群内微生物种类组成不同，其酶切图谱不同，这样就可以得到反映微生物菌群结构组成的DNA凝胶电泳图谱，但这种方法需要多种酶切过程，克隆，比较费时，并且只是一种半定量或定性分析，对于图谱相似的菌群，其组成不一定相同。
发明内容
本发明的目的在于克服以上现有技术的不足，提供一种改进T-RFLP-PCR结合荧光原位杂交技术对虾养殖水体微生物菌群结构快速的检测分析方法，使其检测更加具有快速、准确、特异性的特点，并且对定量检测虾塘水优势菌群亚硝酸盐氧化菌的荧光原位杂交其条件进行优化。
本发明将改进T-RFLP结合FISH技术应用到研究虾养殖水体复杂环境样品中，不经纯培养直接提取虾养殖水体样品中微生物的总的基因组DNA，设计特异性T-RFLP-PCR通用引物(序列上游引物5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′、下游引物5′-CCG TCA ATT CCTTTR AGT TT-3′)，其5’端用6-fam荧光标记，RCR循环反应，扩增得到各种微生物目标DNA片段一端就带有荧光标记，用特异性限制性酶HaeIII对DNA片段消化，不同微生物目标DNA片段因其核苷酸序列不同会导致酶切位点存在差异，产生了不同长度的限制性片段，电泳分离和荧光检测，只有末端带有荧光标记的片段会被检测到。由于核苷酸序列具有多样性，不同微生物的同一个基因的核苷酸序列存在差异，在相同酶切后可能得到不同长度的T-RF，反映在T-RFLP检测中就是不同的荧光信号，通过生成T-RFLP图谱的分析，揭示样品中微生物的种类、数量和种群大小等，从而解析微生物菌群的结构、功能及其动态变化。但是单独依赖T-RFLP技术，也有其缺陷，基于PCR扩增技术，就会受到菌群不同菌种DNA的差异性扩增、目标DNA在菌种间拷贝数的差异、PCR技术本身的偏差以及酶切后T-RF的长度分布也会造成复杂多样性的低估等因素影响，而FISH技术是一种不依赖PCR的分子分析技术可以很好弥补以上的单一依赖PCR的分子检测技术的不足，结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同微生物个体，同时对微生物菌落进行评价。因此运用T-RFLP结合FISH技术，很好结合各自的优点和避免相互不足，定性和定量分析虾养殖水体随着时间变化微生物生态多样性以及优势菌群组成结构的动态变化。
本发明对T-RFLP结合FISH分析技术条件进行了优化，主要对样品总DNA提取，对T-RFLP-PCR设计了特异性引物并确定了循环反应体系与反应参数，优化HaeIII酶切体系，对优势菌群FISH条件优化。
为了获得高质量的总DNA，重复CTAB抽提和氯仿/异戊醇抽提，直到看不见界面为止，以出去多糖和其他污染的大分子，纯化DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
对优势菌群FISH条件优化，主要是对样品的自发荧光进行了消弱，非特异性性杂交进行了消除，确定了合适的杂交时间与洗脱液浓度。
为了消除样品自身荧光的干扰，获得最佳效果，样品优势菌亚硝酸盐氧化菌用4％多聚甲醛固定后又46℃加热固定，用0.2mol/L HCI进行处理，PH6.5，菌悬液稀释倍数104，使其菌体分散程度更好，之后再进行杂交。
对于非特异性杂交的排除，采用了HEX标记探针来解决。实验发现，可以很好的消除假阳性，在490nm激发光下发出橙红色荧光。因此，样品杂交后，并同时进行荧光镜检。
FISH检测的准确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异性，因此实验中对于与靶序列相似具有错配碱基的探针，加入了竞争性探针，使得靶序列很快就可以被检测。亚酸盐氧化菌16SrRNA设计的通用探针NIT3，其5’端用HEX荧光标记，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’；其竞争性探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。CNIT探针与NIT探针同时使用，以确保NIT探针的特异性。
本发明的目的具体通过如下技术方案实现 一种检测虾养殖水体微生物菌群多态性的方法，包括如下步骤和工艺条件 (1)虾养殖水体样品中混合微生物总基因组DNA的提取； (2)设计特异性T-RFLP-PCR通用引物，进行循环反应；所述特异性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物为5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物为5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam荧光标记；PCR反应体系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火温度为57-58℃； (3)产物纯化，用特异性限制性内切酶HaeIII酶切DNA；酶切体系DNA≤1ug；产物纯化是指PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取5ugPCR产物经MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit纯化； (4)微生物菌群多态性结构分析；HaeIII酶切DNA片段与具荧光标记的标准DNA参照物混合后，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，经银染后荧光扫描检测，带有荧光标记的片断被检测，转化为T-RFLP荧光图谱中的各个峰，每一个峰作为一个OUT(末端荧光标记片段或操作分类单元)来进行物种丰度(S＝T-RFLP图谱中显著峰的总数，粗略认为一个峰对应一个不同的物种)、多样性指数(Shannon-Weiner指数H＝-∑PilnPi和Simpson指数D＝1-∑Pi2，其中，Pi表示某个峰的峰高占总高峰的比例)和物种均度(E＝H′/Hmax，其中，Hmax＝ln S)分析；然后对DNA的T-RFLP的指纹图谱条带切胶回收测序，序列通过RDP数据库CHECK-CHIMERA软件分析鉴定是否是形成嵌合片段，并在RDP数据库中Classification进行比对确定分类，将鉴定的序列利用NCBA的Blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行相似性比对，选取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法构建系统发育树；所述1％琼脂糖凝胶是指1g琼脂糖溶于100ml蒸馏水； (5)优势菌荧光原位杂交技术定量检测； a对实验所需玻片进行处理 对玻片进行清洗，硅化处理，以及明胶涂片制备； b样品采集及处理 取原始菌液，加入等量新鲜配制培养基，通入空气，活化1-2天，用去离子水稀释至10-4，随后离心，弃上清液，加入PBS，充分摇匀分散，调节pH至6.0-6.5，调节pH的目的是使聚集在一起的硝化细菌能更好的分散；再将玻片放置到烘箱内热固定，时间为1-3h；再用4％多聚甲醛室温下固定10-20min，冲洗风干；最后将固定后的样品用乙醇脱水3-5min；所述1％琼脂糖凝胶是指1g琼脂糖溶于100ml蒸馏水； c杂交 将探针NIT3及探针CNIT3用HEX标记，将标记好的探针与杂交缓冲液混合于密闭杂交盒中；杂交温度控制在46℃，杂交时间为2-3h，杂交后用洗脱液清晰探针，洗脱液中NaCl浓度为60mmol/L；按组分在杂交缓冲液的浓度计，所述杂交缓冲液由0.01％SDS、40％去离子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1NaCl组成，pH＝7.2； d荧光显微镜观察 玻片在荧光显微镜下观察，在490nm激光下所引起的橙红色荧光反应来定量虾养殖水体优势菌群亚硝酸盐氧化菌，目镜放大倍数为10，物镜放大倍数Mob为20； 为进一步实现本发明目的，所述步骤(1)的虾养殖水体样品中混合微生物总基因组DNA的提取包括如下步骤 a用真空抽滤装置将水样过滤，滤液转移到100ml的离心管，10000-13000rpm离心5-10min，吸去上清液，用无菌水重悬沉淀，转移到1.5ml离心管； b加入567μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，.加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h； c加100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保温10-15min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃于4000-6000rpm下离心10-15min，将上清液转入另一离心管中； d加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸馏水稀释)冷乙醇中洗涤，空气干燥10-15min，100μl TE缓冲液重悬DNA沉淀。
所述步骤(3)用特异限制性内切酶HaeIII酶切DNA是指酶切体系含HaeIII 1ul，10xMBuffer 2ul，DNA≤1ug，灭菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，识别序列GG|CC(G鸟嘌呤，C胞嘧啶)。
所述步骤(5)探针NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探针，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX标记；所述探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
相对于现有技术，本发明所改进的T-RFLP-PCR结合荧光原位杂交技术应用到研究微生物生态系统中微生物菌群多态性，具有简便、快速、灵敏、全面的特点，可以有效地定性和定量分析虾养殖水体随着时间变化微生物生态多样性以及优势菌群组成结构的动态变化。
图1为实施例1(4月1号)取样微生物菌群T-RFLP荧光图谱； 图2-5为实施例2虾养殖苗场水体四次(4月1号，4月16号，5月1号，5月16号)取样微生物菌群T-RFLP荧光图谱； 图6-7为实施例3虾养殖苗场水体不同深度(40cm和150cm)取样微生物菌群T-RFLP荧光图谱。
具体实施例方式 以下结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1 养殖业是我国沿海地区的重要支柱产业，对虾养殖业在其中重要的地位，我国的对虾养殖面积达240万亩。然而由于病害频繁发生，近年我国的对虾养殖产量低于低谷，越来越多的学者认为，虾病的根本原因是养殖生态环境的恶化，污染的环境与养殖生物之间的恶性循环导致了病害的持续爆发。但是传统的分离菌种方法只有一部分能被培养，进行微生物多样性分析时，不能准确地反映混合菌群的组成和多样性。本实验以广东省中山市东升镇的虾养殖苗场为研究对象，用T-RFLP结合FISH技术直接动态检测微生物菌群变化，对虾养殖水体菌群多态性检测的步骤和工艺条件如下 取1号池的水样，1号池6米×10米，水深约2米。3月中旬投放南美白对虾苗15万尾，养殖期间管理同正常生产，4月1号采样一次，多点采集表层30cm以内的水样2000ml，带回实验室真空过滤，滤液-20℃保存。
(1)虾养殖苗场水体样品中微生物总DNA的提取 a.滤液转移到100ml的离心管，10000rpm离心5min，吸去上清液，用无菌水重悬沉淀，转移到1.5ml离心管； b.加入567μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保温10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃于4000rpm下离心15min，将上清液转入另一离心管中； d.加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸馏水稀释)冷乙醇中洗涤，空气干燥15min，100μl TE缓冲液重悬DNA沉淀。
(2)特异性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循环反应 a.T-RFLP-PCR反应体系为25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.5uL，2.5mM的dNTP 1.5uL； b.反应参数94℃变性5min；94℃变性30s，58℃变性30s，72℃变性2min，28次循环；72℃延伸10min； (3)产物纯化，用特异性限制性内切酶HaeIII酶切DNA a.PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取5ugPCR产物经MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit纯化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切体系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.5ug，灭菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多态性结构分析 a.HaeIII酶切DNA片段与具荧光标记的标准DNA参照物混合后，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，经银染后荧光扫描检测，带有荧光标记的片断被检测，转化为T-RFLP荧光图谱中的各个“峰”。每一个峰作为一个OUT来进行分析物种丰度(richness)、多样性指数、物种均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指纹图谱条带切胶回收测序，序列在RDP(ribosomal database project)数据库CHECK-CHIMERA软件分析鉴定是否是形成嵌合片段，并在RDP数据库中Classification进行比对确定分类，然后将鉴定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行相似性比对，选取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法构建系统发育树； (5)优势菌FISH定量检测 A玻片处理 a玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96％酒精浸泡，灼烧，然后在1％(质量分数)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗多次，去离子水洗3次； b硅化处理玻片和盖玻片在1％(质量分数)盐酸中煮沸10min，去离子水洗3次，50℃烘干，锡纸包好4℃保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失； B样品的采集及预处理 a取原始菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上层液体，加入等量新鲜配制培养基，通入空气，活化1d； b取菌液用去离子水稀释，取5ml稀释后样品至10-4，4000r/min条件下离心，弃上清液，加入5mlPBS，充分摇匀分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，调节pH至6.5； c热固定将玻片放置到50℃烘箱内热固定2h； d多聚甲醛固定热固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸馏水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室温下固定15min，用PBS室温冲洗，自然风干； e脱水将固定后的样品，在96％的乙醇中室温下脱水4min，自然风干； C杂交反应 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探针，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探针在5’-端用HEX标记，竞争性探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探针各0.5μL与9.6μL的杂交液在杂交盒内进行杂交反应.。反应时间为2h，杂交温度46℃； D探针的清洗 杂交盒中取出载玻片放入50ml 48℃杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为60mmol/L； E镜检 玻片在荧光显微镜下观察，在490nm激光下所引起的橙红色荧光反应来定量虾养殖水体优势菌群亚硝酸盐氧化菌，目镜放大倍数为10，物镜放大倍数Mob为20； 结果显示水样的genescan图上出现了十几个峰，每个略微突出的部分都可以被认为是一种T-RF，表明水样中至少有十几种类群的菌，分布在电泳进行到15min-30min的范围内，其中在19min-25min出现的峰E、F、I、J占的面积最大，它们的面积之和超过了所有峰总面积的80％，为细菌菌群中的优势菌，其中尤以峰1面积最大，表明该T-RF代表的菌在菌落中的数量最多，优势条带切胶回收测序，与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行系统学分析，没有找到任何相似性高的已知序列，这些片段可能来源于我们还没有了解的未知菌，这样对于虾养殖水体微生物的认识会更加全面，而传统的分离富集培养方法只能培养可培养微生物，微生物的种类、数量和功能都无法反映虾养殖水体的真实情况。
实施例2 用实施例1虾养殖水体环境进行不同时点的菌群检测分析，4月至5月每两周采样一次(4月1号，4月16号，5月1号，5月16号)。多点采集表层30cm以内的水样4×2000ml，带回实验室真空过滤，滤液-20℃保存，对虾养殖水体菌群多态性检测的步骤和工艺条件如下 (1)虾养殖苗场水体样品中微生物总DNA的提取 a.滤液转移到100ml的离心管，13000rpm离心10min，吸去上清液，用无菌水重悬沉淀，转移到1.5ml离心管； b.加入567μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，.加入40μl 10％SDS和5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入90μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保温10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃于5000rpm下离心10min，将上清液转入另一离心管中； d.加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸馏水稀释)冷乙醇中洗涤，空气干燥10min，100μl TE缓冲液重悬DNA沉淀； (2)特异性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循环反应 a.T-RFLP-PCR反应体系为25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反应参数94℃变性3min；94℃变性30s，57℃变性30s，72℃变性2min，28次循环；72℃延伸10min； (3)产物纯化，用特异性限制性内切酶HaeIII酶切DNA a.PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取5ugPCR产物经MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit纯化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切体系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA1ug，灭菌水up to20ul，37℃水域酶切2h； (4)微生物菌群多态性结构分析 a.HaeIII酶切DNA片段与具荧光标记的标准DNA参照物混合后，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，经银染后荧光扫描检测，带有荧光标记的片断被检测，转化为T-RFLP荧光图谱中的各个“峰”。每一个峰可以作为一个OUT来进行分析物种丰度(richness)、多样性指数、物种均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指纹图谱条带切胶回收测序，序列在RDP(ribosomal database project)数据库CHECK-CHIMERA软件分析鉴定是否是形成嵌合片段，并在RDP数据库中Classification进行比对确定分类，然后将鉴定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行相似性比对，选取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法构建系统发育树； (5)优势菌FISH定量检测 A.玻片处理 a.玻片清洗 热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96％酒精浸泡，灼烧，然后在1％(质量分数)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗多次，去离子水洗3次； b.硅化处理 玻片和盖玻片在1％盐酸中煮沸10min，去离子水洗3次，50℃烘干，锡纸包好4℃保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失； B.样品的采集及预处理 a.取原始菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上层液体，加入等量新鲜配制培养基，通入空气，活化1d； b.取菌液用去离子水稀释，取5ml稀释后样品至10-4，4000r/min条件下离心，弃上清液，加入5mlPBS，充分摇匀分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，调节pH至6.0； c.热固定 将玻片放置到50℃烘箱内热固定1h； d.多聚甲醛固定 热固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸馏水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室温下固定10min，用PBS室温冲洗，自然风干； e.脱水将固定后的样品，在96％的乙醇中室温下脱水5min，自然风干； C.杂交反应 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探针，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探针在5’-端用HEX标记，竞争性探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探针各0.5μL与9.6μL的杂交液在杂交盒内进行杂交反应.。反应时间为2.5h，杂交温度46℃； D.探针的清洗 杂交盒中取出载玻片放入50ml 48℃杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为60mmol/L； E.镜检 玻片在荧光显微镜下观察，在490nm激光下所引起的橙红色荧光反应来定量虾养殖水体优势菌群亚硝酸盐氧化菌，目镜放大倍数为10，物镜放大倍数Mob为20。
结果显示T-RFLP结合FISH技术动态监测虾养殖水体随着时间变化，微生物的种类、数量和种群大小等变化，并且将T-RFLP荧光条带对应的DNA切胶回收重新扩增，荧光图谱具有很好的再现性和重复性，对比各个图谱发现，峰I、II、III、IV在每个图上都有，特别是峰II、III、IV的面积之和占有了所有峰总面积的80％，构成该菌群结构的主要种群(如表1)。
表1四种T-RF代表的菌数量
从表1中可以看出，每段片段代表的菌的绝对数量也处在动态变化中。就某一片段来看，片段I代表的菌在4月1号达最大值，而片段II、III和IV代表的菌在5月1号达最大值。片段II、IV代表的菌绝对数量变化幅度达到一个数量级，而片段I、III代表的菌的绝对数量则在同一个数量级上轻微波动。
实施例3 用实施例1虾养殖水体环境，T-RFLP结合FISH技术直接检测虾塘水体微生物菌群垂直(深度40cm和150cm)分布变化，2009年6月5号分别在表层(40cm)和深层(150cm)随机多点取样一次2×2000ml，带回实验室真空过滤，滤液-20℃保存，对虾养殖水体菌群多态性检测的步骤和工艺条件如下 (1)虾养殖苗场水体样品中微生物总DNA的提取； a.滤液转移到100ml的离心管，12000rpm离心8min，吸去上清液，用无菌水重悬沉淀，转移到1.5ml离心管； b.加入567μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，.加入35μl 10％SDS和4μl的20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h； c.加100μl 5mol/LNaCl，充分混匀，再加入100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保温10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃于6000rpm下离心15min，将上清液转入另一离心管中； d.加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸馏水稀释)冷乙醇中洗涤，空气干燥15min，100μl TE缓冲液重悬DNA沉淀； (2)特异性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循环反应 a.T-RFLP-PCR反应体系为25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反应参数94℃变性5min；94℃变性30s，57℃变性30s，72℃变性2min，28次循环；72℃延伸10min； (3)产物纯化，用特异性限制性内切酶HaeIII酶切DNA； a.PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取5ugPCR产物经MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit纯化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切体系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.8ug，灭菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多态性结构分析 a HaeIII酶切DNA片段与具荧光标记的标准DNA参照物混合后，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，经银染后荧光扫描检测，带有荧光标记的片断被检测，转化为T-RFLP荧光图谱中的各个“峰”。每一个峰可以作为一个OUT来进行分析物种丰度(richness)、多样性指数、物种均度(evenness)； b DNA的T-RFLP的指纹图谱条带切胶回收测序，序列在RDP(ribosomal database project)数据库CHECK-CHIMERA软件分析鉴定是否是形成嵌合片段，并在RDP数据库中Classification进行比对确定分类，然后将鉴定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行相似性比对，选取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法构建系统发育树； (5)优势菌FISH定量检测 A玻片处理 a玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96％酒精浸泡，灼烧，然后在1％(质量分数)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗多次，去离子水洗3次； b硅化处理玻片和盖玻片在1％(质量分数)盐酸中煮沸10min，去离子水洗3次，50℃烘干，锡纸包好4℃保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失； B样品的采集及预处理 a取原始菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上层液体，加入等量新鲜配制培养基，通入空气，活化1d； b取菌液用去离子水稀释，取5ml稀释后样品至10-4，4000r/min条件下离心，弃上清液，加入5mlPBS，充分摇匀分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，调节pH至6.3； c热固定将玻片放置到50℃烘箱内热固定2h； d多聚甲醛固定热固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸馏水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室温下固定15min，用PBS室温冲洗，自然风干； e脱水将固定后的样品，在96％的乙醇中室温下脱水3min，自然风干； C.杂交反应 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探针，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3，，探针在5’-端用HEX标记，竞争性探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探针各0.5μL与9.6μL的杂交液在杂交盒内进行杂交反应.。反应时间为3h，杂交温度46℃； D探针的清洗 杂交盒中取出载玻片放入50ml 48℃杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为60mmol/L； E镜检 玻片在荧光显微镜下观察，在490nm激光下所引起的橙红色荧光反应来定量虾养殖水体优势菌群亚硝酸盐氧化菌，目镜放大倍数为10，物镜放大倍数Mob为20。
结果显示T-RFLP图谱6菌群多样性计算物种丰度(richness)S＝4，Shannon-Weiner指数H＝1.26，物种均度(evenness)E＝0.07；T-RFLP图谱7菌群多样性计算物种丰度(richness)S＝9.05，Shannon-Weiner指数H＝3.36，物种均度(evenness)E＝0.47，不同深度的微生物有很大变化，这可能与养殖水体人工小生态系统，承载负荷的能力差，生物量多，生物种类少，环境因子易发生变化，容易引起细菌数量大幅波动，其中500bp大小的条带含5种序列片断，组成情况33％，25％，4％，28％和10％；其中800bp大小的条带含有9种序列片断，组成情况64％，23％，3％，3％，2％，1％，1％，1％和1％；其中1000bp大小的条带含有4种序列片断，组成情况是84.2％，10.2％，4.6％和0.9％，并计算了图谱6与图谱7中Sorenson配对比较相似性系数(pairwise similarity coefficient Cs)最低相似性为86％和83％，说明图谱中的菌群具有很好的连续性和变化性。
以上实验结果充分说明T-RFLP结合FISH方法，可用于监测虾养殖水体复杂微生物菌群的结构特征及优势亚硝酸盐氧化菌群的动态变化。
权利要求
1.一种检测虾养殖水体微生物菌群多态性的方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件
(1)虾养殖水体样品中混合微生物总基因组DNA的提取；
(2)设计特异性T-RFLP-PCR通用引物，进行循环反应所述特异性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物为5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物为5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam荧光标记；PCR反应体系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火温度为57-58℃；
(3)产物纯化，用特异性限制性内切酶HaeIII酶切DNA酶切体系DNA≤1ug；产物纯化是指PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取5ugPCR产物经MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit纯化；
(4)微生物菌群多态性结构分析HaeIII酶切DNA片段与具荧光标记的标准DNA参照物混合后，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，银染后荧光扫描检测，带有荧光标记的片断被检测，转化为T-RFLP荧光图谱中的各个峰，每一个峰作为一个末端荧光标记片段或操作分类单元来进行物种丰度、多样性指数和物种均度分析，然后对DNA的T-RFLP的指纹图谱条带切胶回收测序，序列通过RDP数据库CHECK-CHIMERA软件分析鉴定是否是形成嵌合片段，并在RDP数据库中Classification进行比对确定分类，将鉴定的序列利用NCBA的Blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行相似性比对，选取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法构建系统发育树；所述1％琼脂糖凝胶是指1g琼脂糖溶于100ml蒸馏水；
(5)优势菌荧光原位杂交技术定量检测
a对实验所需玻片进行处理
对玻片进行清洗，硅化处理，以及明胶涂片制备；
b样品采集及处理
取原始菌液，加入等量新鲜配制培养基，通入空气，活化1-2天，用去离子水稀释至10-4，随后离心，弃上清液，加入PBS，充分摇匀分散，调节pH至6.0-6.5，调节pH的目的是使聚集在一起的硝化细菌能更好的分散；再将玻片放置到烘箱内热固定，时间为1-3h，再用4％多聚甲醛室温下固定10-20min，冲洗风干，最后将固定后的样品用乙醇脱水3-5min；所述4％多聚甲醛为4g多聚甲醛溶于100ml蒸馏水；
c杂交
将探针NIT3及探针CNIT3用HEX标记，将标记好的探针与杂交缓冲液(0.01％SDS，40％去离子甲酰胺(DAF)，Tris-HCl(pH＝7.2)20mmol·L-1，NaCl 900mmol·L-1，pH＝7.2)混合于密闭杂交盒中，杂交温度控制在46℃，杂交时间为2-3h，杂交后用洗脱液清晰探针，洗脱液中NaCl浓度为60mmol/L；按组分在杂交缓冲液的浓度计，所述杂交缓冲液由0.01％SDS、40％去离子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1 NaCl组成，pH＝7.2；
d.荧光显微镜观察
玻片在荧光显微镜下观察，在490nm激光下所引起的橙红色荧光反应来定量虾养殖水体优势菌群亚硝酸盐氧化菌，目镜放大倍数为10，物镜放大倍数Mob为20；
2.根据权利要求1所述的检测虾养殖水体微生物菌群多态性的方法，其特征在于所述步骤(1)的虾养殖水体样品中混合微生物总基因组DNA的提取包括如下步骤
a用真空抽滤装置将水样过滤，滤液转移到100ml的离心管，10000-13000rpm离心5-10min，吸去上清液，用无菌水重悬沉淀，转移到1.5ml离心管；
b加入567μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；
c加100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保温10-15min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃于4000-6000rpm下离心10-15min，将上清液转入另一离心管中；
d加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA，1ml 70％冷乙醇中洗涤，空气干燥10-15min，100μl TE缓冲液重悬DNA沉淀；
3.根据权利要求1所述的检测虾养殖水体微生物菌群多态性的方法，其特征在于所述步骤(3)用特异限制性内切酶HaeIII酶切DNA是指酶切体系含HaeIII 1ul，10x M Buffer 2ul，DNA≤1ug，灭菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，识别序列GG|CC(G鸟嘌呤，C胞嘧啶)；
4.根据权利要求1所述的检测虾养殖水体微生物菌群多态性的方法，其特征在于所述步骤(5)探针NIT3是Nitrobacter α-proteobacteria的通用探针，序列为5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX标记；所述探针CNIT3序列为5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
全文摘要
本发明公开了一种对虾养殖水体菌群多态性检测的方法，该方法包括以下步骤(1)虾养殖水体样品中混合微生物总基因组DNA的提取；(2)设计特异性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循环反应；(3)产物纯化，用特异限制性内切酶HaeIII酶切DNA；(4)1％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，荧光扫描；(5)微生物菌群多态性结构分析；(6)菌群优势菌荧光原位杂交技术定量检测。本发明改进T-RFLP-PCR结合FISH检测技术，并且用荧光标记特异性引物，与现代技术相比有重复性高、灵敏、快速、准确、稳定等特点，可以定性和定量分析虾养殖水体随着时间变化微生物生态多样性以及优势菌群组成结构的动态变化。
文档编号G01N21/64GK101724690SQ20091004228
公开日2010年6月9日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者林炜铁, 高利海, 张星, 朱雅楠, 罗剑飞 申请人:华南理工大学