一种检测apoe基因多态性的引物及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测ΑΡ0Ε基因多态性的引物及其方 法。
【背景技术】
[0002]载脂蛋白E(apolipoprotein Ε,ΑροΕ)是血楽:中重要的载脂蛋白之一，其基因定位 于第19对染色体长臂上，长37kb，其包含4个外显子和3个内含子。ApoE有三种构体 (isoform)即E2、E3和ELApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸 (Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg;E2都 是Cys;112位为Cys和158位是Arg者为Ap 〇E3异构体，在自然人群中，基因频率E3分布最高， ApoE3/3表型分布约70%。人群中可有六种不同的表型：三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三 种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)。
[0003] ApoE主要在肝脏合成、分泌和代谢，参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑 制血小板聚集、免疫调节等作用。李冬梅等发表了一篇题目为"ΑΡ0Ε基因多态性与阿尔茨海 默病的相关性研究"的论文，该论文表明ΑΡ0Εε4等位基因，HDL-C与散发性AD有关联，ΑΡ0Εε4 可能是散发性AD发病的危险因素，并建议把ΑΡ0Εε4和HDL-C等作为散发性AD的生物标记。现 代研究发现，ApoE基因多态性还与冠心病(coronary heart disease，CHD)、高脂血症、脑梗 塞、Alzheimer病(AD)和慢性乙型肝炎等疾病有着密切的关系。因此，研究和开发出检测 ApoE基因多态性的方法或试剂盒对临床具有重大的意义。
[0004] 中国专利申请201110446186. X公开了 ΑΡ0Ε基因检测试剂盒及扩增方法和检测方 法，所述试剂盒包括检测基因 APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物，所述检 测ΑΡ0Ε基因 rs429358位点的引物包括正向野生型引物和正向突变型引物;所述检测ΑΡ0Ε 基因 rs7412位点的引物包括正向野生型引物和正向突变型引物;所述APOE基因内参引物 包括正向内参引物和反向共用引物。所述ΑΡ0Ε基因检测试剂盒是对受检样本DNA分别用野 生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和1个内参片段 进行扩增，扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带 的有无判断2个SNP位点的基因型。
[0005] 中国专利申请201510288426.6公开了检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其 PCR方法，所述检测ApoE基因多态性的引物包括检测rs429358位点和rs7412位点的两组引 物。该检测试剂盒能够大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使 不同位点间的非特异性交叉扩增的可能性降到最低，能够做到真正"全或无"式的扩增，不 仅有很好的特异性，也具有非常好的灵敏度，能检出lng基因组DNA中的基因型分布情况。
[0006] 然而，上述的ApoE基因多态性的检测引物较复杂，而且检测步骤较繁琐，不利于该 检测方法的推广和利用。因此，研究和发开出检测方法简单，操作便捷，引物特异性高，检测 结果精确度高的ApoE基因多态性的检测方法仍是目前研究的重点。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种检测ΑΡ0Ε基因多态性的引物及 其方法，该引物主要用于检测ΑΡ0Ε基因中APOE _T112Ch和AP0E_ C158T的两个位点，具有特 异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为ΑΡ0Ε基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
[0008] 本发明提供了一种检测ΑΡ0Ε基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物为：针对ΑΡ0Ε的上游引物5 ' - GCCTACAAATCGGAACTGGA-3 '（SEQ ID N0.1)和下游引物5'- ACCTGCTCCTTCACCTCGT-3'（SEQ ID N0.2);所述SNaPshot PCR引 物包括：针对AP0E_T112C的SNaPshot PCR引物5 ' -GCGCGGACATGGAGGACGTG-3 '（ SEQ ID N0.3);针对 AP0E_C158T 的 SNaPshot PCR 弓| 物5'_ ttttttttttttttttttgcgatgccgatgacctgcagaag_3' （SEq ID N〇.4)。
[0009] 进一步地，所述SNaPshot PCR引物中AP0E_T112C与AP0E_C158的引物浓度比为1: 1〇
[0010] 另外，本发明还提供了一种检测ΑΡ0Ε基因多态性的方法，包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0011] 进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0012] 进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2: 98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。
[0013] 进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。
[0014] 进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0015] 除此之外，本发明提供的检测ΑΡ0Ε基因多态性的引物在制备检测ΑΡ0Ε基因多态性 试剂中的用途。
[0016] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势:本发明提供的检测ΑΡ0Ε 基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了 ΑΡ0Ε基因多 态性的检测，为冠心病、中风和阿尔茨海默病早期预防等疾病提供了风险或参考依据，同时 还可以辅助ΠΙ型尚脂蛋白血症的诊断，具有重大的临床意义。
【附图说明】
[0017]图1为本发明提供的ΑΡ0Ε基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的ΑΡ0Ε基因 SNaPshot PCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0019]实施例一、引物 本发明提供的ΑΡ0Ε基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，所述 PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数 据库比对，无已知SNP位点。
[0020]表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于U