一种检测tpmt基因多态性的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测ΤΡΜΤ基因多态性的引物与方 法。
【背景技术】
[0002] 琉嚷岭类药物属于抑制嚷岭合成途径的细胞周期特异性药物，能竞争性抑制次黄 嚷岭转变，阻碍DNA合成，抑制淋己细胞增殖，是临床上常用于白血病、实体肿瘤的抗癌治疗 和器官移植后的免疫抑制治疗的药物。在急性淋己细胞白血病(Α化)的治疗和改善预后中， 琉嚷岭类药物发挥了重要的作用，已有研究显示A化治疗方案中含琉嚷岭的维持治疗是减 少复发和提高无病生存率的重要环节。同时，现有研究也表明，治疗A化的抗嚷岭代谢药 物一6-琉基嚷岭(6-MP)和6-琉代鸟嚷岭(6-TG)等均是无内在生物活性的药物，必须通过体 内一系列代谢后才能发挥其抗白血病效应。琉嚷岭甲基转移酶(ΤΡΜΤ基因编码)是琉嚷岭代 谢过程的关键酶之一，能利用S-腺巧-心甲硫氨酸（SAM)作为甲基的供体和底物结合，特异 地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子甲基化而使其转变成具有生物活性的中间 产物。琉嚷岭甲基转移酶活性缺乏者，琉嚷岭转化率降低，使用标准剂量的琉嚷岭治疗可能 会导致严重的毒副反应。
[0003] 关于ΤΡΜΤ的研究结果发现，琉嚷岭甲基转移酶活性降低或缺乏与其等位基因多态 性密切相关，目前已发现18种可能会引起琉嚷岭甲基转移酶活性降低的ΤΡΜΤ单核巧酸多态 性（SNPs)位点，对不同人种进行的研究发现，ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C运3 个ΤΡΜΤ基因多态性位点最为常见，其余的则比较罕见。ΤΡΜΤ活性缺乏的患者服用标准计量 琉嚷岭后药物在体内代谢障碍，将会导致较为严重的琉嚷岭相关毒副作用，因此使用琉嚷 岭治疗相关疾病的过程中，建议筛查使用琉嚷岭患者的ΤΡΜΤ基因类型，W指导临床琉嚷岭 药物剂量的调整。
[0004] 中国专利CN101333560公开了一种嚷岭类药物敏感基因忍片检测试剂盒，可用于 检测ΤΡΜΤ基因的ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C多态性位点，但基因忍片的设计 成本高，检测费用昂贵，而且其敏感度不高，检测结果的可重复性差。现有技术中缺少一种 检测特异性和灵敏度高、准确性和精密性好、可实现同时检巧UTPMT基因多个多态性位点的 检测引物及其方法。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测ΤΡΜΤ基因多态性的引物与方 法，具有不发生交叉反应，检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性好等优点，实现了 ΤΡΜΤ 基因3个多态性位点ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C的同时检测。本发明同时检测 的位点包括ΤΡΜΤ基因巧(NM_000367.3: C. 238G〉C，rsl800462)、TPMT基因*3B(NM_000367.3: C. 460G〉A，rsl800460) W及ΤΡΜΤ 基因*3C(NM_000367.3: C. 719A〉G，rsl 142345)。
[0006] 本发明提供一种检测ΤΡΜΤ基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR 引物;所述PCR扩增引物包括:针对ΤΡΜΤ基因巧的上游引物5 ' -GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3 ' (沈Q ID N0.1)和下游引物5'-TTCCACACCAACTACACTGT-3'（沈Q ID 側.2)，针对了口]?1'基因* 38的上游引物5'-〇64〔6(：了6(：^41'(：1'1'(：門44-3'（56〇10肋.3)和下游引物5'-CACCTGGATTGATGGCAACTAA -3'（SEQ ID N0.4)W及针对TPMT基因*3C的上游引物5'-AATCCCTGATGTCATTCTTCATAGTATTT-3 '（ SEQ ID NO . 5 )和下游弓| 物 5 '-CATCCATTACATTTTCAGGCTTTAGCATAAT-3'（沈QIDN0.6);所述S化PshotPCR引物包括：针 对TPMT基因*2的SNaPshotPCR引物5'-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3'（SEQIDN0.7)，针对 TPMT基因*3B的SNaPshotPCR引物5'-TTTTTTTTTTGACATGATTTGGGATAGAGGA-3'（SEQID N0.8)，W及针对TPMT基因*3C的SNaPshot PCR 引物5'-TTTTTTTTTTTTTTGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTAT-3 '（SEQ ID NO.9)。
[0007]采用上述技术方案，本发明提供的检测TPMT基因多态性的引物，可W同时实现 TPMT基因3个多态性位点TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的特异性检测，不发生交 叉反应，准确性好。
[000引优选地，所述PCR扩增引物中，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物浓 度比为1:1:1;所述SNaPshot PCR引物中，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物 浓度比为1:1:1。
[0009]相应地，本发明还提供一种检测TPMT基因多态性的方法，包括如下步骤： 51、 提取DNA样品； 52、 W步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求域帥所述的PCR扩增引物进行多 重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，； 53、 W步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1或2中所述的 SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； 54、 采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的挪aPshot PCR扩增产物进行检测， 并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0010 ] 优选地，所述步骤S1中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[00川优选地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:98°C预变性3min，98°C变性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，进行29个循环，最后72°C延伸5min，结束后25°C保溫。
[0012] 优选地，所述步骤S3中的挪aPshot PCR扩增反应条件包括:96°C变性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，进行25个循环，结束后4°C保溫。
[0013] 优选地，所述步骤S4中，采用GE肥MAP阳RID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0014] 此外，本发明还提供检测TPMT基因多态性的引物在制备检测TPMT基因多态性试剂 中的用途。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供了一种检测TPMT基因多态性 的引物，该引物的特异性好，可同时实现TPMT基因3个多态性位点TPMT基因巧、TPMT基因*3B 和TPMT基因*3C的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好，提高了检测效率。此外，本发 明还提供了一种检测TPMT基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和 SNaPshot PCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性和精密性好等优点，检测结果可用于 嚷岭类化疗药物个体化用药的临床指导。
【附图说明】
[0016] 图1本发明提供的TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C引物的部分扩增片 段。
[00Π ] 图2本发明提供的TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C引物扩增产物的部分 测序图。
[001引图3样品的TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C检测结果图。
【具体实施方式】
[0019] W下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护化围。
[0020] 实施例一引物 发明人针对TPMT基因的3个多态性位点TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C，设计 了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且 PCR反应条件非常接近的引物。本发明提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物和挪aPshot PCR引物，PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。如针对TPMT基因*2，上游引物为 5 ' -GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3 '（SEQ ID NO. 1)，下游引物为5 ' -TTCCACACCAACTACACTGT-3'（沈QIDN0.2)，SNaPshotPCR引物为5'-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3'（沈QIDN0.5)。本 发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
[0021] 实施例二引物的特异性 将本发明提供的ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3B和ΤΡΜΤ基因*3C引物于UCSC中进行B1 as t，结 果如下：ΤΡΜΤ基因巧扩增片段位于c虹6:18143923-18144086，长度为164bp; ΤΡΜΤ基因*3B扩 增片段位于chr6: 18139204-18139334，长度为13 lbp;TPMT*3C扩增片段位于chr6: 18130816-18131066dTPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C特异引物的扩增片段及基因 组位置如图1所示，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点：TPMT基因巧、TPMT基因* 3B和TPMT基因*3C，无其它同源基因。
[0022] 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品DNA进行