扩增及Sanger测序，部分测序结 果如图2所示。测序结果显示，各引物扩增片段与TPMT基因参考序列吻合。TPMT基因参考序 列号为TPMT: NG_012137.2 ; NM_000367.3。
[0023] 使用表1中測aPshot PCR引物，S化Pshot法进行检测，部分结果如图3所示。从图3 可知，各产物峰的相对位置及测序反应渗入的碱基与预期相符，无其它干扰峰。
[0024] 实施例Ξ TPMT基因多态性的检测 1、提取抓TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自 Τ iagen，货号DP318 )的说明书，将DNA样品稀释至1 OOng/yL，备用。
[002引 2、多重PCR扩增 (1)配制PCR扩增引物混合物，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物浓度比 为1:1:1，震荡混匀，短暂离屯、后备用。PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自 肥B公司，货号M049化），W提取得到的样本DM为模板，反应体系如表2所示。
[0026] (2)多重PCR扩增反应条件包括:98°C预变性3min，98°C变性10s，58°C退火30s，72 °C延伸Imin，进行29个循环，最后72°C延伸5min，结束后25°C保溫。
[0027] (3)PCR扩增结束后，取PCR扩增产物取1.化L做琼脂糖凝胶电泳检测有片段，表明 PCR扩增成功； (4)多重PCR扩增产物纯化，取2. ΟμΙ ExoSAP-IT(购自Affymetrix，货号78205)和3. ΟμΙ ddH20，混匀，加入2.化LPCR扩增产物，震荡混匀，短暂离屯、后在PCR仪中进行酶切反应，反应 条件包括:37°C保溫15 min; 80°C保溫15min; 4°C保溫。
[002引 3、SNaPshot 反应 (1)配置SNaPshot PCR引物混合物，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物浓 度比为1:1:1，震荡混匀，短暂离屯、后备用。W纯化后的多重PCR扩增产物为DNA模板，采用 SNaPshot? Multiplex Kit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如表3所示。
[0029] (2)化Pshot PCR反应条件包括:96°C变性10s，55°C退火5s，60°C延伸30s，进行25 个循环，结束后4°C保溫。
[0030] (3)SNaPshot PCR产物纯化，在挪aPshot PCR产物中加入Ι.ΟμΙ SAP酶，震荡混匀， 短暂离屯、后在PCR仪中进行酶切反应，反应条件包括:37°C保溫60min; 75°C保溫15min; 4°C 保溫。
[0031] 4、利用毛细管电泳技术对纯化后的SNaPshot PCR产物进行检测，检测结果采用 GE肥MAP阳RID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
[0032] 实施例四TPMT基因多态性检测方法的特异性 本检测方法的检测特异性定义为阴性符合率。本检测将TPMT基因巧G/G、TPMT基因 *3B G/G和TPMT基因 *3C A/A基因型的检出定义为阴性结果。
[0033] 采用本发明提供的挪aPshot测序法对20例样品进行检测，检测结果采用Sanger测 序法进行验证。挪aPshot测序法检测出的阴性结果与Sanger测序法显示的结果相符，无突 变的样本(阴性)共18例，如表4所示。本检测方法的检测特异性为100%。
[0034] 实施例五ΤΡΜΤ基因多态性检测方法的灵敏度 本检测方法的检测灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot测序法对20 例样品进行检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。測aPshot测序法检测出的阳性结 果与Sanger测序法结果相符，突变的样本（阳性)共2例如表5所示。本检测方法的检测灵敏 度为 100〇/〇。
[0035]
实施例六TPMT基因多态性检测方法的准确度 本检测方法的准确度定义为不同方法检测结果的一致性。20例样品经挪aPshot测序法 检测的检测结果和Sanger测序法显示的结果相符，如表6所示。本检测方法的准确度为 !00%〇
[0036] 实施例屯ΤΡΜΤ基因多态性检测方法的精密度 本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了 人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表7所示，所有结果均 显示一致，本检测精密度为100%。其中，位点1:ΤΡΜΤ巧C.238G〉。位点2:ΤΡΜΤ*3Β C.460G〉 八;位点3:了口]\0'*3(：〇.7194〉6。
[0037] 因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法， 解决了 ΤΡΜΤ基因* 2、ΤΡΜΤ基因* 3Β和ΤΡΜΤ基因* 3C进行准确分型鉴定问题，发挥了 PCR- S化Pshot PCR对所述基因位点基因分型结果精确、高通量操作的特点。本发明提供的引物 和检测方法特异性高，检测方法的灵敏度、准确度和精密度好，可用于临床检测TPMT基因多 态性，检测结果对临床嚷岭类化疗药物的个体化用药具有很大的指导作用。
【主权项】
1. 一种检测TPMT基因多态性的引物，其特征在于，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引 物;所述PCR扩增引物包括:针对TPMT基因*2的上游引物5 ' -GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3 '和 下游引物5 ' -TTCCACACCAACTACACTGT-3 '，针对TPMT基因*3B的上游引物5 ' -GGACGCTGCTCATCTTCTTAA-3 ' 和下游引物5 ' -CACCTGGATTGATGGCAACTAA -3 ' 以及针对TPMT基 因 *3C的上游引物5 ' - AATCCCTGATGTCATTCTTCATAGTATTT-3 ' 和下游引物5 ' -CATCCATTACATTTTCAGGCTTTAGCATAAT -3' ；所述SNaPshot PCR引物包括：针对TPMT基因*2的 SNaPshot PCR引物5'-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3'，针对TPMT基因*3B的SNaPshot PCR引物 5 ' -TTTTTTTTTTGACATGATTTGGGATAGAGGA-3 ' 以及针对TPMT基因 *3C的SNaPshot PCR引物5 ' -TTTTTTTTTTTTTTGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTAT-3 '。2. 根据权利要求1所述的检测TPMT基因多态性的引物，其特征在于，所述PCR扩增引物 中，TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物浓度比为1:1:1;所述SNaPshot PCR引 物中，TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物浓度比为1:1:1。3. -种检测TPMT基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 提取DNA样品； 52、 以步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多 重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化； 53、 以步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1或2中所述的 SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； 54、 采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的SNaPshot PCR扩增产物进行检测， 并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。4. 根据权利要求3所述的检测TPMT基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤S1中的 DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。5. 根据权利要求3所述的检测TPMT基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤S2中的多 重PCR扩增反应条件包括:98°C预变性3min，98°C变性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，进 行29个循环，最后72°C延伸5min，结束后25°C保温。6. 根据权利要求3所述的检测TPMT基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤S3中的 SNaPshot PCR扩增反应条件包括:96°C变性10s，55°C退火5s，60°C延伸30s，进行25个循环， 结束后4 C保温。7. 根据权利要求3所述的检测TPMT基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤S4中，采 用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。8. 根据权利要求1或2所述的检测TPMT基因多态性的引物在制备检测TPMT基因多态性 试剂中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测TPMT基因多态性的引物与方法。本发明提供的检测TPMT基因多态性的引物包括TPMT基因3个多态性位点TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的检测TPMT基因多态性的引物与方法可以同时实现TPMT基因3个多态性位点TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的特异性检测，不会发生交叉反应，检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性好，可用于临床检测TPMT基因多态性，检测结果可用于嘌呤类化疗药物个体化用药临床指导。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506096
【申请号】CN201511007885
【发明人】胡昌明, 梁耀铭, 于世辉, 赵薇薇, 燕启江, 郭周萍
【申请人】广州金域检测科技股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月30日