检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别设及检测D0CK2基因多态热点突变情况 的引物和方法。
【背景技术】
[0002] 联合免疫缺陷病是一种多基因遗传病，其可分为:x性联遗传、常染色体隐性遗传 型和散发型。联合免疫缺陷病将导致淋己样干细胞先天性分化异常，婴儿出生后缺乏T细胞 和B细胞，使体液免疫和细胞免疫均发生缺陷，不能合成自己的免疫球蛋白，从而导致患者 对细菌、真菌、病毒等缺乏抵抗力，易发侵袭性感染。患儿在出生后1-2个月内发病，如得不 到有效治疗，多于1岁内死亡。目前国外已经将该病列为"急诊病例"，一旦诊断明确立即进 行造血干细胞移植，能及时为患儿赢得新生。
[0003] D0CK2基因位于人类第5号染色体上，总长446136bp，共52个外显子。D0CK2基因编 码的蛋白质属于CDM蛋白家族。它在造血细胞中特异性表达，主要在外周血白细胞，并通过 活化Rac来参与淋己细胞的迁移所需的肌动蛋白细胞骨架重构。当D0CK2基因发生突变， Racl的活化受损，趋化因子诱导的迁移和肌动蛋白的聚合在T细胞、B细胞和NK细胞中发生 缺陷。缺乏运种基因的小鼠在淋己细胞的迁移和引导中表现出严重的损伤。近来Do化S等人 报道，其在5名联合免疫缺陷病的患者体内发现胞质分裂2基因(D0CK2)的等位基因突变，其 中3名患者通过干扰素或D0CK2表达治疗后正常化。提示Dock2的突变情况对联合免疫缺陷 病有重要意义。对D0CK2的突变检测无疑能对联合免疫缺陷病的早诊断和及时的针对性治 疗起重要作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测D0CK2基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可 用于快速检测骨髓增生异常综合征患者体内D0CK2基因多态位点的突变情况。所述检测 D0CK2基因多态热点突变情况的引物，包括：
[0005] 扩增D0CK2基因的引物，其碱基序列为：
[0006] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT
[0007] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0008] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0009] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0010] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[0011] D0CK2-3R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA
[0012] D0CK2-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0013] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0014] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG
[0015] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0016] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG
[0017] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[001引进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
[0019] 检测D0CK2基因的测序引物碱基序列为：
[0020] Ml3F:TGTAAAACGACGGCCAGT
[0021] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0022] 进一步地，引物序列D0CK2-1F和D0CK2-1R是扩增D0CK2基因第6外显子序列的引 物，引物序列D0CK2-2F和D0CK2-2R是扩增D0CK2基因第22外显子序列的引物，引物序列 D0CK2-3F和D0CK2-3R是扩增D0CK2基因第33外显子序列的引物，引物序列D0CK2-4F和 D0CK2-4R是扩增D0CK2基因第37外显子序列的引物，引物序列D0CK2-5F和D0CK2-5R是扩增 D0CK2基因第40外显子序列的引物，引物序列D0CK2-6F和D0CK2-6R是扩增D0CK2基因第44外 显子序列的引物。
[0023] 本发明还提供了检测D0CK2基因第6、22、33、37、40、44号外显子突变情况的方法， 包括W下步骤：
[0024] 1.抽提血液/中的DNA;
[002引 2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA;
[0026] 3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
[0027] 4.对测序结果进行判断，确定D0CK2基因是否发生突变；
[002引其中PCR扩增引物为：
[0029] 扩增D0CK2基因的引物，其碱基序列为：
[0030] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT
[0031] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0032] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0033] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0034] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[00；35 ] D0CK2-3R: AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [00；36] D0CK2-4F: TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0037] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0038] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG
[0039] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0040] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG [0041 ] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[0042] 进一步地，测序引物碱基序列为；
[0043] 检测D0CK2基因的测序引物碱基序列为：
[0044] Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0045] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0046] 本发明还提供了一种检测D0CK2基因多态突变位点的试剂盒，包括：
[0047] (i)血液DNA抽提试剂；
[0048] (i i)检测体系PCR扩增反应液；
[0049] (iii)测序体系试剂；
[0050] 其中PCR扩增反应液引物为：
[00引](i)扩增D0CK2基因的引物，其碱基序列为：
[0052] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT [005；3] D0CK2-1R:AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0054] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0055] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0056] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[0057] D0CK2-3R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [005引 D0CK2-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0059] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0060] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG [0061 ] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0062] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG
[0063] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[0064] 进一步地，测序引物碱基序列为；
[00化]Ml3F:TGTAAAACGACGGCCAGT
[0066] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0067] 有益效果:本发明设计了扩增D0CK2第6、22、33、37、40、44号外显子序列的引物。采 用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火溫度等反应条件，可使扩增效 率达到最佳。D0CK2基因的突变类型不定，因此本发明所述引物既能将所述D0CK2全部6、22、 33、37、40、44外显子序列都扩增出来，也保证无论运些外显子的何处位置发生突变，都不会 出现漏检的情况。相比较巧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。巧光定量PCR法要针对 不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。
【附图说明】
[0068] 图1为D0CK2基因在染色体上定位图
[0069] 图2为D0CK2-1F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图2所示，引物D0CK2-1F/R扩增有效，且条带单一。
[0070] 图3为D0CK2-2F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图3所示，引物D0CK2-2F/R扩增有效，且条带单一。
[0071] 图4为D0CK2-3F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图4所示，引物D0CK2-3F/R扩增有效，且条带单一。
[0072] 图5为D0CK2-4F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图5所示，引物D0CK2-4F/R扩增有效，且条带单一。
[0073] 图6为D0CK2-5F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图6所示，引物D0CK2-5F/R扩增有效，且条带单一。
[0074] 图7为D0CK2-6F/R的电泳图，Μ为Marker DL 2000,1-16为送检的血液样本1-16号， 如图7所示，引物D0CK2-6F/R扩增有效，且条带单一。
[00 巧]图8、9、10、11、12、13 分别为样本1、2、3、4、5、6的 D0CK2 第 6、22、33、37、40、44 号外显 子野生型测序截图。
【具体实施方式】
[0076] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0077] 实施例1
[0078] 一种检测D0CK2基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对D0CK2突变热点所 设计的特异性扩增引物，包括：
[0079] 扩增D0CK2基因包含第6、22、33、37、40、44号外显子序列的引物，其碱基序列为：
[0080] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT [0081 ] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0082] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0083] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0084] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[00 化]D0CK2-3R:AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [00 化]D0CK2-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0087] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0088] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACG