细胞系种属鉴定的引物对及其应用
【专利摘要】本发明公开了细胞系种属鉴定的引物对及其应用，该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。本发明引物对可用于细胞系种属和物种种属鉴定中，能降低细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，简化操作，促进细胞系质量监测标准化。
【专利说明】
细胞系种属鉴定的引物对及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及细胞系种属鉴定技术。
【背景技术】
[0002] 很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行，这些细胞可能是从细胞库得来，也 可能是受赠于其它研究人员，尤其在中国，目前细胞的传播太复杂、无序，很多都不是通过 正规途径获得，如友情赠送等。
[0003] 据统计，约30 %细胞系被交叉污染或错误辨识，因使用了交叉污染或错误辨识的 细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果，这浪费大量时间、精 力和金钱，还可能造成不可挽回的灾难性后果。
[0004] 因此，近年NIH、ATCC、Nature和Science等对此多次发出呼吁，要求研究者对细胞 进行鉴定，如2011年美国国家标准学会专门颁布了一份细胞STR鉴定国家标准；2014年12 月、2015年2月Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识严重性；2015 年4月Nature通知:Nature旗下杂志将从5月开始要求作者鉴定论文中所用细胞系；2015年6 月有报道称一科学家由于用错细胞系，撤销Nature论文。
[0005] STR(Short TandemRepeat，短串联重复序列）基因分型已被ICLAC、ATCC等权威机 构作为金标准应用于细胞鉴定，目前越来越多的杂志要求在投稿时提供细胞STR分型数据。 与细胞系STR鉴定一样，细胞系是否存在种属间的交叉污染鉴定也同等重要，美国国家标准 研究所(American National Standards Institute，ANSI)公布了一个细胞种属鉴定的标 准:ANSI/ATCC ASN-0003-2015,而使用此标准ANSI/ATCC ASN-0003-2015需要收取较高费 用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供适用于细胞系种属鉴定的，鉴定准确性高，操作简单的引物 对。
[0007] 本发明的另一个目的是提供上述引物对在细胞系种属鉴定中的应用。
[0008] 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
[0009] 本发明提供的细胞系种属鉴定的引物对，为引物对1或引物对2或引物对3中的任 意一种;所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的正向引物IF和核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的反向引物IR组成;所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的正向引 物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如 SEQ ID N0:5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的反向引物3R组成。
[0010] 本发明人用引物对1分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示 测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，且不同种属测得序列之间的差异性明 显，说明引物对1确实可以实现细胞系种属的准确鉴定;该引物对1在进行细胞系种属鉴定 时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基 因组来进行调整，本发明推荐引物对1的PCR反应条件为:94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C 延伸42s。
[0011] 本发明人用引物对2分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示 测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，且不同种属测得序列之间的差异性明 显，说明引物对2确实可以实现细胞系种属的准确鉴定;该引物对2在进行细胞系种属鉴定 时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基 因组来进行调整，本发明推荐引物对2的PCR反应条件为:94 °C变性30s，52 °C退火30s，72 °C 延伸42s。
[0012] 本发明人用引物对3分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示 测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，且不同种属测得序列之间的差异性明 显，说明引物对3确实可以实现细胞系种属的准确鉴定;该引物对3在进行细胞系种属鉴定 时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基 因组来进行调整，本发明推荐引物对3的PCR反应条件为:94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C 延伸72s。
[0013] 本发明的引物对1或引物对2或引物对3可应用于细胞系种属鉴定，从而加速细胞 质量监测的标准化;也可以作为辅助手段，用于细胞系种属鉴定。
[0014] 本发明的引物对1或引物对2或引物对3可应用于物种种属鉴定。
[0015] 本发明的引物1或引物对2或引物对3可以制备成试剂盒，用于细胞系种属鉴定或 物种鉴定。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0017] 1.现有技术中尚未有一对引物可以同时扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因 序列；本发明采用生物信息技术优势开发出能用于多个物种鉴定的3对引物对，这3对引物 对每1对引物都可以扩增出人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴这7个物种的目的片段，且同一对 引物扩增出的序列各物种间差异性明显；
[0018] 2.本发明引物对的应用可大大降低了细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，而且大 大简化了细胞系种属鉴定或物种鉴定的操作，促进了细胞系质量监测标准化。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。
[0020] 实施例1引物对的获得
[0021] 1、基因组来源
[0022] 人（human)、狗（dog)、猪（pig)、兔（rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒河猴 (rhesus)这7个物种的基因组数据是从Genebank上下载的该物种最新版本的基因组，具体 基因组数据来源如表1所示。
[0023]表1基因组数据来源
[0026] 2、基因组 DNA
[0027] 本发明人委托泰因生物科技有限公司实验室用TAKARA公司的基因组总DNA提取试 剂盒提取获得人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒河 猴(rhesus)的基因组DNA。
[0028] 3、目标序列筛选
[0029] 本发明人采用Iastz作为比对软件来比对和分析人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔 (rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组，然后通过Iinux运行比对 程序。
[0030] 以兔和狗的基因组比对为例，其比对参数如表2所示。
[0031] 表2 Iastz比对参数
[0033] 基因组比对总共得到6个比对结果文件，分别为兔与人、大鼠、小鼠、狗、猪、恒河猴 的比对结果。由于6个物种都是以兔的基因组做为参考序列来进行的比对，所以可以得到每 个物种和兔基因组的同源区域。根据这6个物种和兔同源区域的重叠，进而筛选出人、大鼠、 小鼠、狗、猪、恒河猴和兔这7个物种同源的区域以及基因组序列，总共筛选出7个物种共有 的同源性大于70%且小于100%，同源区域长度大于200bp的序列57620组。
[0034]由于设计引物需要连续相同的序列超过18bp，因此，对上述57620组序列进行进一 步地过滤，过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数小于2个的序列区域，得 到了可以用来设计引物的873组同源序列。
[0035]为了保证序列可以区分出物种的差异，选取物种间差异度较大的序列来设计PCR 引物。
[0036] 4、引物设计
[0037]目标片段筛选完成后，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。
[0038]引物设计的要求是:选取能够完全涵盖目标片段的引物，引物长度在18~24bp之 间，退火温度52°C~60°C。
[0039] 则最终设计得到3对引物，分别是引物对1、引物对2和引物对3;所述引物对1由核 苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的正向引物IF和核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的反向引物 IR组成;所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的反向引物2R组成;所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示的正向引 物3F和核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的反向引物3R组成。
[0040] 实施例2引物对1鉴定细胞系种属实验
[0041] 本实施例用设计的引物对1进行细胞系种属鉴定的实验。
[0042] 引物对1由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子 水充分溶解到浓度为1 ΟμΜ，室温静置30分钟，4 °C保存。
[0043] 分别以人(human)、狗（dog)、猪（pig)、兔（rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒 河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的 TAKARA Premix Taq试剂盒，PCR反应体系（20yL)如表3〇
[0044] 表3引物对1的PCR反应体系
[0046] 将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为： 94 °C 3niin；
94 0C 55 C
[0047] 72 0C 72 "C 8min； 16°C 保存。
[0048] 将上述PCR产物物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明 亮;扩增片段大小为682bp;扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
[0049]以狗(dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID N0:7所 示；
[0050]以小鼠（mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
[0051 ]以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
[0052]以大鼠（rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0053]以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0054]以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 12 所示；
[0055]以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0056] 将上述SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比 对，通过与原始序列的同源性来确定用引物对1进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列， 结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，详见表4。
[0057]表4引物对PCR得到的序列与原始序列相似度（％ )
[0059] 从表4可以看出，引物对1可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
[0060] 引物对1扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表5所示。
[0061 ] 衷；5引物对〗扩增的目标序列在不同物种中的序列相似庠（％ ) LUUOOj /yv 衣 3 Kl 以 _ DD , '十刀刈丄 φ 丄自 DD
H 仞 外江丨口」'十刀 丁 98.8%，说明引物对1扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对 应多个物种的情况，由此证明引物对1确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
[0064] 实施例3引物对2鉴定细胞系种属实验
[0065] 本实施例用设计的引物对2进行细胞系种属鉴定的实验。
[0066] 引物对2由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子 水充分溶解到浓度为1 〇μΜ，室温静置30分钟，4 °C保存。
[0067]分别以人(human)、狗（dog)、猪（pig)、兔（rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒 河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的 TAKARA Premix Taq试剂盒，PCR反应体系（20yL)如表6〇 [0068] 表6引物对2的PCR反应体系
[0071 ] 将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为： 94 °C 3 min；
941： 52 °C
[0072] 72 C ITC 8min； 16 0C 保存。
[0073] 将上述PCR产物物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明 亮;扩增片段大小为693bp;扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
[0074]以狗（dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 14 所示；
[0075]以小鼠（mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0076]以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示；
[0077]以大鼠（rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示；
[0078]以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示；
[0079]以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 19 所示；
[0080]以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所示。
[0081 ] 将SEQ ID NO: 14~SEQ ID NO:20所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比对，通 过与原始序列的同源性来确定用引物对2进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果显 示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，详见表4。
[0082] 从表4可以看出，引物对2可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
[0083] 引物对2扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表7所示。
[0084] 表7引物对2扩增的目标序列在不同物种中的序列相似度（％ )
[0086] 从表7可以看出，引物对2扩增出的目标序列在不同物种间的相似度均小于 97.3%，说明引物对2扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对 应多个物种的情况，由此证明引物对2确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
[0087] 实施例4引物对3鉴定细胞系种属实验
[0088] 本实施例用设计的引物对3进行细胞系种属鉴定的实验。
[0089] 引物对3由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子 水充分溶解到浓度为1 ΟμΜ，室温静置30分钟，4 °C保存。
[0090] 分别以人(human)、狗（dog)、猪（pig)、兔（rabbit)、大鼠（rat)、小鼠（mouse)和恒 河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的 TAKARA Premix Taq PCR试剂盒，PCR反应体系（20yL)如表8〇
[0091] 表8引物对3的PCR反应体系
[
[0093] 将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为： 94 °C 3 min；
94!'C 56〇C
[0094] 72〇C 72 C 16°C 保存。
[0095] 将上述PCR产物物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明 亮;扩增片段大小为1189bp;扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
[0096]以狗（dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID N0:21 所示；
[0097]以小鼠（mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 22所示；
[0098]以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 23所示；
[0099]以大鼠（rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示；
[0100]以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 25所示；
[0101] 以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID N0:26 所示；
[0102] 以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。
[0103] 将SEQ ID N0:21~SEQ ID N0:27所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比对，通 过与原始序列的同源性来确定用引物对3进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果显 示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99%以上，详见表4。
[0104] 从表4可以看出，引物对3可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
[0105] 引物对3扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表9所示。
[0106] 表9引物对3扩增的目标序列在不同物种中的序列相似度（％)
[0108]从表9可以看出，引物对3扩增出的目标序列在不同物种间的相似度均小于 96.9%，说明引物对3扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对 应多个物种的情况，由此证明引物对1确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
【主权项】
1. 一种细胞系种属鉴定的引物对，其特征在于该引物对为引物对1或引物对2或引物对 3中的任意一种;所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的正向引物1F和核苷酸序 列如SEQ ID N0:2所示的反向引物1R组成;所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示 的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的反向引物2R组成;所述引物对3由核苷酸 序列如SEQ ID N0:5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的反向引物3R组 成。2. 根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对1的PCR反应条件为94°C变性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 42s。3. 根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对2的PCR反应条件为94°C变性 30s，52°C 退火 30s，72°C 延伸 42s。4. 根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对3的PCR反应条件为94°C变性 30s，56°C 退火 30s，72°C 延伸 72s。5. 权利要求1所述引物对在细胞系种属鉴定中的应用。6. 权利要求1所述引物对在物种种属鉴定中的应用。7. 权利要求1所述引物对在制备细胞系种属鉴定试剂盒或物种种属鉴定试剂盒中的应 用。
【文档编号】C12N15/11GK106086230SQ201610741909
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月28日
【发明人】杜红丽, 蒙裕欢
【申请人】广州泰因生物科技有限公司