一种鉴定三七的特异引物对及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定三七的特异引物对及方法。
【背景技术】
[0002] 五加科人参属Panax主要药用植物为：人参Panax ginseng C. A. Mey.、西洋参 Panax quinquefolium L.和三七 Panax notoginseng(Burkill)F. H. Chen ex C. Chow&ff. G. Huang;人参主要产于我国东北三省和朝鲜，被誉为"百药之王"；西洋参原产于美国威斯 康辛州和加拿大安大略省；我国市场上的西洋参为进口与引进种植两种。三七主产于云 南、广西，为五加科（Araliaceae)人参属（Panax)植物三七 Panax notoginseng (Burkill) F.H. Chen的干燥根，是常用名贵中药材，性温，味甘、微苦，具有止血散痪、消肿定痛的功能， 其提取物三七皂苷具有强心、活血、促进血液循环等作用，临床用于出血、跌打损伤、胸腹刺 痛及痈疽肿毒等，在中医骨伤科、外科、妇科等具有广泛的用途和独特的疗效，加之其价格 昂贵。市场上经常出现与其形态相似的伪品充作三七，不仅造成了药材市场的混乱，而且伪 品不仅不具有药理作用，甚至可能产生毒副作用，对临床用药安全带来危害。
[0003]二者都是我国常用的珍贵药材，人参、二七自1963年起历版《中国药典》均有收 载，西洋参自《中国药典2000年版一部》起有收载。上述三者由于来源于同科同属不同种植 物的相同部位，因而其内部组织构造、所含化学成分均有很大相似之处，给实际工作中的鉴 定增加了难度，对于鉴别单味及成方制剂，难度就更大。目前HPLC法是最常用的鉴别方法， 但常出现基线漂移较大、峰分布不均、分离度差或分离出的峰数较少等问题，难以达到理想 的鉴定效果。且市场存在相互混用的情况，由于三者药性和药效有很大区别，而传统的分析 鉴别方法，是根据形态和组织结构特征和化学成分上鉴别，王贺等采用溶血实验的方法进 行鉴别；崔秀明等采用HPLC指纹图谱鉴定；而这些传统的鉴别方法干扰因素较多，易受环 境和植物本身的影响和限制；故要求采用先进的鉴定技术进行区分，从而保证患者的用药 安全，建立一种用于鉴别三七的方法就具有非常重要的意义。
[0004] 现代分子生物学技术能从分子水平上客观地反映物种的基因片段差异，克服了传 统鉴别方法主观性大、易受干扰等缺点，具有操作简单、特异性强、重复性好、所需检样量小 等优点。对传统中药鉴别方法进行补充，将先进的分子生物学技术与传统研宄结合起来， 是中药研宄现代化的重要手段，现行《中国药典》2010年版一部采用聚合酶链式反应法，作 为乌梢蛇、蕲蛇炮制品的质量评定方法，标志着分子生物学技术已经作为法定的中药鉴定 方法之一，扩充了中药鉴定的科学内涵。本发明通过特异性PCR的方法实现了三七的快速、 准确鉴别。目前，尚未有任何公开或报道过本发明所提及的引物对及方法。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定三七的特异引物对及方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007] 所述引物对包括引物F1和引物F2 :
[0008] 引物 F1 的序列为 5' -TmTTTAAATAAATTAAATAAAITTAAAG-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0009] 引物 F2 的序列为 5' -ITCATCATTAITTCTTTCTTATCTT-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0010] 所述鉴定三七的方法包括如下步骤：
[0011] (1)采用常规方法提取待测样品的DNA，然后采用本发明所述的引物对对待测样 品的DNA进行PCR扩增反应，得扩增产物；
[0012] 5XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus) 5. 0 y L，dNTPs mixture (2. 5mM) 2. 5 y L，鉴别 引物FI (10 yM) 0.75 yL，引物F2 (10 yM) 0.75 yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara， 2. 5U/ y L) 0. 25 y L，DNA模板1. 0 y L，无菌双蒸水补充体系至25 y L。
[0013] PCR扩增反应参数如下：95°C预变性3min，98°C变性10s，47°C退火15s，72°C延伸 lmin，30个循环后，72°C延伸7min。
[0014] (2)电泳所述扩增产物，若存在分子量约为241bp的特异条带，则确定待测样品为 二七。
[0015] 关于本发明特异引物对设计的说明：
[0016] 一、三七、人参、西洋参鉴别引物所锚定的序列具有种内高度保守的特点，且三者 之间存在较小的差异，因此设计出一对能鉴别三七的特异性引物的难度相当大：
[0017] 1.人参、西洋参和三七分别在NCBI进行Blast相似度比较，具有95%以上的相似 度，差别极小：人参与西洋参序列Blast比较，相似度98%;人参和三七序列Blast比较，相 似度96% ;西洋参和三七序列Blast比较，相似度95%。
[0018] 2.采用DNAMAN软件对三者进行相似度比较，一致性98. 82 %。
[0019] 二、发明人在三七、人参、西洋参鉴别引物设计的前后过程长达2年，前期一共设 计了 30余对引物试图能将三七、人参、西洋参鉴别出来，现略举数例以说明引物设计的艰 难筛选过程：
[0020] 1、UP 5' -TCGGCGATAGTCACATTG-3'（SEQ ID N0. 3)
[0021] L0 5' -TCGGCGATAGATGCAGTATA-3'（SEQ ID NO. 4)
[0022] 采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用 Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参、西洋参、三七各2个样本，退火温 度46 °C，无特异条带。
[0023] 2、UP 5' -CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3'（SEQ ID N0. 5)
[0024] L0 5, -CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3，（SEQ ID NO. 6)
[0025] 采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用 Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参4个样本、西洋参4个样本、三七 10个样本，退火温度56°C，从图中可知，西洋参也出现相同的条带，所以，不能鉴别三七。
[0026] 3、UP 5, -AGCAGGTCAAGAAGTGGATTG-3,（SEQ ID N0. 7)
[0027] L0 5' -GAAAGAGTAGGCGGTTGAAAG-3'（SEQ ID NO. 8)
[0028] 采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带