Rna纯化方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年3月15日递交的美国临时申请61/799, 705的权益，为了各 种目的将其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
[0003] 本发明属于RNA纯化领域，特别是用于制药用途（例如用于使动物免疫）的对来 自复杂样品（如在RNA的体外转录后获得的样品）的大型RNA的大规模纯化和配制的方法。
[0004] 发明背景
[0005]RNA作为各种制药应用的新型备选物出现，但有效纯化仍是个挑战。这部分由于样 品中不希望的污染物的不同类型和组合，而需要将这些污染物从所需的RNA种类中分离以 获得纯的RNA样品。该污染物通常为任何上游过程（例如RNA制备）的组分和和副产物。 当使用体外转录来制备大型RNA时，在转录成功后样品通常含有所需的RNA种类，以及各种 污染物，如不希望的RNA种类、蛋白质、DNA或其片段、焦磷酸酯以及游离核苷酸。
[0006] 商业的下游应用（如作为药物组合物和/或疫苗的制剂和用途）对用于大型RNA 的纯化方法提出更多限制，其要求：（i)在保留RNA稳定性和功能的同时获得高纯度；（ii) 与RNA的体内递送的制剂需求的相容性；和（iii)符合良好的制备实践。此外，为了促进工 业应用，任何RNA纯化方法都必须确保持续、低成本且省时的操作（如快速、简单、可重复、 高产率的大规模纯化）。
[0007] 用于纯化大型RNA的方法在本领域已知。Pascolo等人（2006)描述了一种从分析 规模的体外转录反应样品中纯化mRNA的方法（纯化20μ1样品体积中的25μgRNA)。该 方法涉及DNA酶处理，随后用氯化锂使较长的mRNA析出。然而，该作者报道该方法不提供 高纯度的RNA，因为其不会完全除去污染物，如DNA和蛋白质。此外，该方法涉及使用有机溶 剂，并且费时费力，涉及36个步骤之多，要求在不同条件下频繁人工处理样品，其中包括 至少一个过夜培育步骤。因此，尽管该方法可满足研究和实验室规模的RNA纯化需求，但其 具有下列缺点：低RNA纯度、重复性，并且不适合在商业规模下纯化制药级别的RNA，因而不 适合在工业过程中实践。
[0008]W02008/077592公开了一种通过使用多孔反相固定相的离子配对反相HPLC以制 备规模纯化大型RNA的方法。据报道，使用该特定的多孔固定相的特殊优点在于，可避免压 力过高，有助于RNA的制备性纯化。然而，该方法涉及对分离柱使用有毒（harsh)有机溶剂 (如乙腈）和高温（78°C)，而采样器则采用低温（12°C)。并未说明可使用该方法从所需 RNA中成功分离的污染物的性质，也没有说明对在先步骤（如DNA酶处理）的任何要求。此 外，基于离子配对反相HPLC或基于离子交换树脂的RNA的色谱分离是基于分子的总电荷， 并对至多约4, 000至5, 000个碱基的RNA分子的纯化有效。然而，大型RNA分子的纯化经 受尺寸排阻效应和较差回收率的问题。此外，该方法依赖于使用有机溶剂对RNA的洗脱，但 由于残留物的潜在安全考虑、较高的购买成本、其环境影响和对RNA稳定性及效应的潜在 有害影响，在理想情况下应避免有机溶剂洗脱。
[0009] 因而仍存在对进一步改善的RNA纯化方法的需求，特别是那些允许在保留RNA的 稳定性、生物效应和功能的同时具有高产率和制药级别纯度的在工业规模下对大型RNA进 行低成本且省时纯化的方法。特别需要这样的方法，其中起始样品为复杂的生物样品，如大 型RNA的体外转录后获得的样品。
[0010] 发明详述
[0011] 为了解决这些需求，本发明提供了一种用于从样品中纯化RNA的方法，其包括一 个或多个正切流动过滤步骤、一个或多个羟磷灰石色谱步骤、一个或多个核心珠流通色谱 (corebeadflow-throughchromatography)步骤或它们的任意组合。这些技术可独立 使用，当在组合使用或以特定顺序进行时显示非常高的效率。该方法可以高效的方式纯化 RNA，而不会对效力或稳定性造成不恰当的破坏，从而提供其中RNA基本不含污染物的组合 物。此外，这些方法可无需有机溶剂来进行，并且优选本发明的方法在水性条件下发生。本 发明的进一步的优点为：使用基本上一次性的组分，这意味着它们可被制备为完全干净的 形式（特别是不含RNA酶的形式），仅使用一次，然后丢掉，因此避免了操作之间一直携带的 污染物，这对于避免RNA酶的污染特别有效。该方法还十分快速。
[0012] 在一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括一 个或多个正切流动过滤步骤。
[0013] 在另一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括 一个或多个羟磷灰石色谱步骤。
[0014] 在另一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括 一个或多个核心珠流通色谱步骤。
[0015] 在一个有用的实施方式中，该方法包括正切流动过滤步骤和羟磷灰石色谱步骤。 正切流动过滤步骤优选在羟磷灰石色谱步骤之前。
[0016] 在另一个有用的实施方式中，该方法包括核心珠流通色谱步骤和羟磷灰石色谱步 骤。优选地，核心珠流通色谱步骤在羟磷灰石色谱步骤之前。
[0017] 在任一个前述实施方式中，所述RNA纯化步骤之后可存在一个或多个缓冲液更换 步骤，如包括正切流动过滤。
[0018] 因而本发明提供了从样品中纯化和配制RNA的方法，其中该方法包括一个或多个 RNA纯化的步骤和一个或多个缓冲液更换步骤。优选地，至少一个缓冲液更换步骤包括正切 流动过滤。
[0019] 在一个实施方式中，本发明提供了纯化和配制RNA的步骤，包括两个独立的正切 流动过滤步骤。优选地，在第一步正切流动过滤中使用第一缓冲液，且在第二步正切流动过 滤中使用不同的第二缓冲液。第一缓冲液和第二缓冲液通常基于两种不同的缓冲盐。例如， 第一缓冲液可为基于Tris的缓冲液，而第二缓冲液可为柠檬酸盐缓冲液。优选地，第一缓 冲液为纯化缓冲液，且第二缓冲液为配制缓冲液。更优选地，纯化缓冲液包含浓度在50至 500mM之间，例如250mM的盐。
[0020] 例如，纯化缓冲液可包含浓度在0至500mM之间的盐，如约10mM、约20mM、约25mM、 约 50mM、约lOOmM、约 150mM、约 200mM、约 250mM、约 300mM、约 350mM、约 400mM、约 450mM、约 500mM、约 10mM至约 500mM、约 10mM至约 400mM、约 10mM至约 300mM、约 10mM至约 250mM、约 20mM至约 500mM、约 20mM至约 400mM、约 20mM至约 300mM、约 20mM至约 250mM、约 30mM至约 500mM、约 30mM至约 400mM、约 30mM至约 300mM、约 30mM至约 250mM、约 40mM至约 500mM、 约 40mM至约 400mM、约 40mM至约 300mM、约 40mM至约 250mM、约 50mM至约 500mM、约 50mM 至约400mM、约40mM至约300mM或约50mM至约250mM等。
[0021] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其在正切流动 过滤步骤之前包括核心珠流通色谱的步骤。在优选的实施方式中，在核心珠流通色谱步骤 中使用第一缓冲液，并在正切流动过滤的步骤中使用第二缓冲液。优选地，第一缓冲液为纯 化缓冲液，且第二缓冲液为不同的配制缓冲液。更优选地，纯化缓冲液包含盐，如氯化钾或 氯化钠。最优选地，纯化缓冲液包含浓度在100至500mM之间，如250mM的氯化钾。
[0022] 例如，纯化缓冲液可包含浓度在0至500mM之间的氯化钾，如约50mM、约75mM、约 100mM、约 150mM、约 200mM、约 250mM、约 300mM、约 350mM、约 400mM、约 450mM、约 500mM、约 50mM至约 500mM、约 50mM至约 400mM、约 50mM至约 300mM、约 50mM至约 250mM、约 75mM至约 500mM、约 75mM至约 400mM、约 75mM至约 300mM、约 75mM至约 250mM、约 100mM至约 500mM、 约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、或约100mM至约250mM等。
[0023] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其包括第一步 正切流动过滤，然后第二步羟磷灰石色谱，然后第三步正切流动过滤。在优选的实施方式 中，在第一步正切流动过滤中使用第一缓冲液，在第二步羟磷灰石色谱中使用不同的第二 缓冲液，并在第三步正切流动过滤中使用不同的第三缓冲液。优选地，第一和第二缓冲液为 纯化缓冲液，且第三缓冲液为不同的配制缓冲液。优选地，第一缓冲液不含氯化钠和/或氯 化钾。最优选地，在另一步骤中，在第一步正切流动过滤之后和第二步羟磷灰石色谱之前， 将氯化钠和/或氯化钾加入含RNA的样品中，直至达到100至500mM之间的最终浓度，如 250mM或 500mM。
[0024] 例如，可向含RNA的样品中加入氯化钠和/或氯化钾，直至达到0至500mM之间的 最终浓度，如约 50mM、约 75mM、约 100mM、约 150mM、约 200mM、约 250mM、约 300mM、约 350mM、 约 400mM、约 450mM、约 500mM、约 50mM至约 500mM、约 50mM至约 400mM、约 50mM至约 300mM、 约 50mM至约 250mM、约 75mM至约 500mM、约 75mM至约 400mM、约 75mM至约 300mM、约 75mM 至约 250mM、约 100mM至约 500mM、约 100mM至约 400mM、约 100mM至约 300mM、或约 100mM至 约250mM等。
[0025] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其包括第一步 核心珠流通色谱，然后第二步羟磷灰石色谱，然后第三步正切流动过滤。在优选的实施方式 中，在第一步核心珠流通色谱中使用第一缓冲液，在第二步羟磷灰石色谱中使用不同的第 二缓冲液，并在正切流动过滤中使用不同的第三缓冲液。优选地，第一和第二缓冲液为纯化 缓冲液，且第三缓冲液为不同的配制缓冲液。优选地，第一缓冲液不含氯化钠和/或氯化 钾。最优选地，在另外的步骤中，在第一步核心珠流通色谱之后和第二步羟磷灰石色谱之前 将氯化钠和/或氯化钾加入含RNA的样品中，直至达到100至500mM之间，如250mM或500mM 的最终浓度。
[0026] 例如，可向含RNA的样品中加入氯化钠和/或氯化钾，直至达到0至500mM之间的 最终浓度，如约 50mM、约 75mM、约 100mM、约 150mM、约 200mM、约 250mM、约 300mM、约 350mM、 约 400mM、约 450mM、约 500mM、约 50mM至约 500mM、约 50mM至约 400mM、约 50mM至约 300mM、 约 50mM至约 250mM、约 75mM至约 500mM、约 75mM至约 400mM、约 75mM至约 300mM、约 75mM 至约 250mM、约lOOmM至约 500mM、约lOOmM至约 400mM、约lOOmM至约 300mM、或约lOOmM至 约250mM等。
[0027] 本发明还提供了用于从样品（如体外转录反应的产物）中纯化RNA的方法，其中 在低于12小时内（如〈8小时、〈6小时、〈4小时或〈2小时），该RNA被纯化至至少99%的 纯度（如彡99. 9%或甚至彡99. 95% )。
[0028] 在本发明的方法中，其步骤通常涉及丢弃不含RNA(或不含所需的RNA种类）的物 质，同时留下含有RNA(或所需RNA种类）的物质。因而，当一种技术将起始物分为几部份 时，将保留所需部分同时可丢弃不需要的部分；类似地，如果一种技术保留不希望的部分但 使所需RNA流出，则应保留流出液。
[0029] RNA
[0030] 根据本发明，从含RNA的样品中纯化所需的RNA。本发明的所需RNA可为双链，但 优选为单链。当RNA为单链时，如mRNA或自我复制的RNA复制子时，其通常编码一种或多 种蛋白，并且其中至少一种可用作下述的免疫原，但也可为任意感兴趣的非免疫原性治疗 性或预防性蛋白（如作为基因治疗药物的组分）。本发明所需的RNA可为环形，但优选为链 形。
[0031]RNA可为负链，但优选为正链，这样其可不需任何中间复制步骤（如反转录）就被 细胞翻译。优选的正链RNA为自我复制，如下所述。优选地，RNA不是天然病毒RNA。
[0032]RNA可为小型、中型、大型RNA。小型RNA每条链的核苷酸数为10至30 (如siRNA)。 中型RNA每条链含有30至2000个核苷酸（如非自我复制的mRNA)。大型RNA每条链含有 至少2, 000个核苷酸，如每条链至少2, 500个、至少3, 000个、至少4, 000个、至少5, 000个、 至少6, 000个、至少7, 000个、至少8, 000个、至少9, 000个、或至少10, 000个核苷酸（如 下述的自我复制的RNA)。以g/mol(或道尔顿）给出的单链RNA分子的分子量可大约使用 以下公式计算：分子量=(RNA核苷酸数）x340g/mol。
[0033] 如在W02011/005799中讨论的，RNA(特别是自我复制的RNA)除了任何5'帽结构 外还可包括一个或多个具有修饰的核碱基的核苷酸。例如，RNA可包括一个或多个修饰的 嘧啶核碱基，如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。然而，在一些实施方式中，RNA包括无修 饰的核碱基，并且可包括无修饰的核苷酸，即RNA中的所有核苷酸为标准A、C、G和U核糖核 苷酸（除了任何5'帽结构，其可包括7'-甲基鸟苷）。在其它实施方式中，RNA可包括包 含7' -甲基鸟苷的5'帽，并且第一 1、2或3、5'核糖核苷酸可在核糖的2'位被甲基化。
[0034] 本申请使用的RNA优选地仅在核苷之间包括磷酸二酯连接基，但在一些实施方式 中其可包含氨基磷酸酯连接基、硫代磷酸酯连接基和/或甲基磷酸酯连接基。
[0035] 本发明尤其适合自我复制的RNA的纯化。当被递送至脊椎动物细胞时，即使没有 任何蛋白，自我复制的RNA分子（复制子）也可通过其自身的转录（通过由其自身产生的 反义副本）产生多个子RNA(daughterRNA)。因而自我复制的RNA分子通常为正链分子，其 在被递送至细胞后可被直接翻译，并且该翻译提供了由RNA依赖性RNA聚合酶，该RNA依赖 性RNA聚合酶随后从被递送的RNA中产生反义和正义转录本。因而被转录的RNA导致产生 多个子RNA。这些子RNA以及共线亚基因组转录本自身可被翻译以提供感兴趣的被编码 蛋白（如免疫原）的原位表达，或可被转录以提供与被递送的RNA同义的进一步的转录本， 其被翻译而提供蛋白（如免疫原）的原位表达。该转录序列的总体结果为所引入的复制子 RNA数量的巨幅扩增，且因此被编码的免疫原成为细胞的主要多肽产物。在W02012/006369 和TO2013/006838种公开了合适的自我复制的RNA。
[0036] 实现自我复制的一种合适的系统为使用基于α病毒的RNA复制子。在被递送至 细胞后，这些正链复制子被翻译以产生复制酶（或复制酶-转录酶）。复制酶被翻译为多聚 蛋白，其自动剪切以提供产生被递送的正链RNA的基因组负链副本的复制复合体。这些负 链转录本自身可被转录以提供正链母RNA的进一步的副本，还提供编码免疫原的亚基因组 转录本。亚基因组转录本的翻译因而导致被感染细胞原位表达免疫原。合适的α病毒复 制子可使用来自辛德比斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒 等的复制酶。可使用突变型或野生型病毒序列，如在复制子中使用VEEV的减弱TC83突变 体（W02005/113782)。
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