一种家蚕肽聚糖识别蛋白的表达和纯化方法与流程

本发明属于昆虫免疫领域，特别涉及一种家蚕肽聚糖识别蛋白（pgrp-s1）的原核表达。

背景技术：

家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝用来制作丝绸，销售于海内外，带动了相关企业的发展，极大的促进了我国的经济发展。蚕蛹中含有丰富的蛋白质，可食用。蚕沙和蚕蜕的皮可入药，具有重要的药用价值。所以为了提高家蚕成活率，增强家蚕对病原微生物的抵御能力，研究家蚕免疫是必不可少的。而且关于蚕对微生物病原体免疫的文献已经有越来越多被报道。

家蚕属于鳞翅目昆虫，既是重要的经济昆虫，又是重要的模式生物。家蚕缺乏后天免疫，在与微生物的长期进化过程中形成了一套比较完善的免疫机制即先天免疫，用来抵御病原微生物的入侵。家蚕先天免疫主要依靠模式识别受体识别病原体相关分子模式进而激活先天免疫通路，从而杀死微生物。这些病原体相关分子模式只存在病原微生物而不存在宿主中，如脂多糖、肽聚糖等，这些病原体相关分子模式被相应的模式识别受体识别，从而激活下游的信号通路。肽聚糖识别蛋白（pgrp）家族是家蚕最重要的模式识别受体，它可以识别病原微生物的肽聚糖，进而触发家蚕的免疫通路，从而激活或抑制抗菌肽的表达。有研究表明，家蚕感染革兰氏阴性菌激活imd通路得到免疫应答，革兰氏阳性菌激活imd通路得到免疫应答，但也有证据报道表明这两种途径之间相互联系。

家蚕的基因组中已鉴定出12个肽聚糖识别蛋白基因，这些肽聚糖识别蛋白具有一个pgrp结构域，用来结合病原微生物的肽聚糖，进而启动或抑制抗菌肽的合成。已有证据表明一些肽聚糖识别蛋白也可以触发酚氧化酶通路的激活，促进黑化作用。一些肽聚糖识别蛋白也可以直接作为杀菌剂杀死细菌。

技术实现要素：

本发明提供了一种家蚕肽聚糖识别蛋白s1的原核表达载体的构建。

本发明是通过下列技术方案实现的：

家蚕肽聚糖识别蛋白s1原核表达的方法，从家蚕脂肪体组织中提取总rna，通过逆转录合成cdna，以此为模板，通过设计引物从家蚕脂肪体组织中扩增得到家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因。

家蚕肽聚糖识别蛋白s1原核表达的方法，

设计引物的上游引物是5'-cgcaggatccgacatggcccgcctcc-3'（bamh1）,（seqidno.1）；

下游引物是5'-attagcggccgctcttgatggagtccacgttct-3'(not1)（seqidno.2）。设计的引物中插入酶切位点，以便于用分子克隆的方法将家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因克隆到原核表达载体pet-30a中，将构建好的原核表达载体转化dh5α，将菌液pcr和酶切验证的阳性克隆测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒转化bl21（de3）。

家蚕肽聚糖识别蛋白s1原核表达的方法，将测序正确的bl21（de3）过夜培养，然后以1:100用新鲜培养基稀释，继续培养至od值大约在0.5左右，加入终浓度为0.8mm的iptg和质量浓度为20%的葡萄糖诱导，诱导时间为5h。由于表达的蛋白带有his标签，可以用镍离子螯合磁珠进行纯化。

镍离子螯合磁珠进行纯化包涵体蛋白的方法，按照下述步骤进行：

（1）将诱导的菌液离心，收集沉淀，将沉淀用1×pbs洗涤两次，离心弃上清，沉淀加入适量的1×pbs并悬浮，冰上超声（功率：25%，运行3秒、间歇8秒，25次）裂解，离心，分别取上清和沉淀进行12%sds-page，以确定目的蛋白的可溶性。

（2）样品处理：沉淀用适量的包涵体洗涤液（1m盐酸胍、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）重悬，离心弃上清。沉淀用适量的包涵体裂解液（6m盐酸胍、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）重悬，离心得到上清。

（3）磁珠预处理：用buffera（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）平衡镍离子螯合磁珠磁珠与目的蛋白结合：磁珠中加入样品处理步骤中离心得到的上清液，使目的蛋白与磁珠结合。

（4）磁珠洗涤：用bufferb（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=6.0）和bufferc（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=5.3）对磁珠进行洗涤，以除去杂蛋白。

（5）目的蛋白洗脱：用bufferd（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=4.0）洗脱目的蛋白。

（6）目的蛋白复性：采用透析法对包涵体进行复性。

本发明的优势之处：免除了从家蚕组织中提取蛋白的繁琐步骤，极大的节约实验成本和时间。

附图说明

图1为pcr扩增家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因的结果，图中：1-6:以脂肪体为模板，梯度pcr扩增s1基因；

图2为菌液pcr结果，图中：1：dl5000dnamarker；2-3：一个菌落的菌液pcr产物；3-4：另一个菌落的菌液pcr产物；

图3为重组质粒的双酶切结果，图中：1：dl5000dnamarker；2-3：重组质粒的双酶切产物；

图4为iptg诱导目的蛋白表达的结果，图中：1：蛋白marker；2：未诱导菌液；3：iptg诱导的菌液；

图5为确定目的蛋白是否存在于沉淀中，图中：1：未诱导菌液；2：iptg诱导的菌液；3：超声处理后取总菌液；4：超声处理后取上清液；5：超声处理后取沉淀；

图6为纯化的目的蛋白sds-page结果，图中：1：蛋白marker；2：未诱导菌液；3：纯化前的蛋白；4：纯化的蛋白；

图7为纯化的目的蛋白westernblot结果图，中：1：未诱导菌液；2：纯化前的蛋白；3：纯化的蛋白。

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的和优势，结合实施例对本发明做进一步的解释。所举实施例只用来解释本发明，但并不限定本发明。

实施例1：获得家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因

用于pcr扩增基因所用的高保真酶购自takara公司，引物是由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

首先，根据genbank公布的核苷酸序列（nm_001043371）设计引物，上游引物为5'-cgcaggatccgacatggcccgcctcc-3'（bamh1）,下游引物为5'-attagcggccgctc

ttgatggagtccacgttct-3'(not1)。其次，从家蚕中分离脂肪体提取mrna，逆转录为cdna。以cdna为模板，通过所设计的引物进行pcr，扩增出家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因。用1%琼脂糖凝胶检测（参见图1）。

实施例2：家蚕肽聚糖识别蛋白s1基因表达菌的构建

用于构建的宿主菌dh5α和bl21（de3），pet-30a质粒由本实验室保存，dh5α和bl21（de3）制成感受态细菌。bamh1和not1，连接酶均购自takara公司。质粒提取试剂盒购自omaga公司。

对扩增的肽聚糖识别蛋白s1基因和pet-30a进行双酶切，使用快速连接酶将双酶切肽聚糖识别蛋白s1基因连接到同样双酶切的pet-30a上，于16℃水浴2h，并转化dh5α感受态细菌。将转化的dh5α涂布于含卡那霉素（30μg/ml）的lb固体培养基上，37℃倒置培养过夜。将平板上的菌落进行菌液pcr验证，使用两对引物进行验证（参见图2）。将菌液pcr验证正确的菌落过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒用于双酶切验证（参见图3），将验证正确的目的克隆测序。测序成功的目的克隆质粒转化bl21（de3），筛选出含有目的基因的菌落。

实施例3：诱导目的蛋白的表达

将含有目的基因的bl21（de3）挑菌落于含卡那霉素（30μg/ml）的lb液体培养基中，37℃培养过夜，然后按1:100稀释接种于新的含卡那霉素（30μg/ml）的lb液体培养基中37℃培养至od值大约在0.5左右，加入终浓度为0.8mm的iptg和20%的葡萄糖诱导，诱导时间为5h，4℃4500rpm离心25min，收集菌体，进行12%sds-page验证是否表达（参见图4）。

实施例4：纯化目的蛋白

镍离子螯合磁珠购自海狸纳米科技（苏州）有限公司。

将收集的细菌用20ml1×pbs清洗两次，4℃4500rpm离心25min，收集菌体。用10ml1×pbs重悬菌体，冰上超声（功率：25%，运行3秒、间歇8秒，25次）裂解，4℃12000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行12%sds-page，以确定目的蛋白的可溶性（参见图5）。

样品处理：沉淀用10ml包涵体洗涤液（1m盐酸胍、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）重悬，离心弃上清，重复一次。沉淀用10ml包涵体裂解液（6m盐酸胍、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）重悬，离心得到上清。

磁珠预处理：将磁珠充分混匀，吸取1ml磁珠悬液于离心管中，将离心管置于磁性分离器上，待溶液澄清后移去保存液。从磁性分离器取下离心管。加入10mlbuffera（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=7.8）使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，移去上清液，重复洗涤2次以平衡镍离子螯合磁珠。

磁珠与目的蛋白结合：磁珠中加入样品处理步骤中离心得到的上清液，将离心管置于旋转混合仪上旋转20min，使目的蛋白与磁珠结合。之后将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，移去上清液。

磁珠洗涤：依次加入10mlbufferb（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=6.0）和bufferc（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=5.3）对磁珠进行洗涤，以除去杂蛋白。最后加入10mlbufferc使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管中，以防止杂蛋白的污染。

目的蛋白洗脱：用5mlbufferd（8m尿素、20mm磷酸钠、500mmnacl,ph=4.0）洗脱目的蛋白。

目的蛋白复性：采用透析法对包涵体进行复性，透析外液分别为a(20mm磷酸钠、500mmnacl、4m尿素，ph4.0)、b(20mm磷酸钠、500mmnacl、2m尿素，ph4.0)、c(20mm磷酸钠、500mmnacl、1m尿素，ph4.0)、d(20mm磷酸钠、500mmnacl、0m尿素，ph4.0)，每次透析时间为4小时。

实施例5：12%sds-page分析和westernblot验证

一抗（anti-his）二抗（羊抗鼠igg）购自南京诺唯赞生物科技有限公司

12%sds-page分析：取100μl纯化的目的蛋白加入20μl5×sdsloadingbuffer煮沸5min,12000rpm离心5min，取20μl上样。进行12%sds-page，用考马斯亮蓝染色液染色2h,用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜（参见图6）。

westernblot验证：将纯化的蛋白到pdvf膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h，用tbst洗涤4次，加入一抗（anti-his1:1000稀释），4℃过夜，pdvf膜用tbst洗涤4次，加入二抗（羊抗鼠igg1:5000稀释）1h，tbst洗涤4次，加入显色液，ecl显色（参见图7）。

上述实施例为本发明较为优化的条件，由图6和图7可证明，纯化出的蛋白较好。本发明的实验方法并不受上述实施例的限制，在本发明实验原理的前提下，所做的修饰和改进都属于本发明的保护范围之内。

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<110>江苏大学

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