专利名称：：保存二级肽结构的制作方法保存二级肽结构
背景技术：
：发明领域本发明涉及在冷冻干燥过程中对某些肽的a-螺旋二级结构的保存方法，还涉及根据此方法制备的此类肽的冷冻干燥制剂。相关
背景技术：
：APP018和APL180为已知脱脂载脂蛋白(即o)A_I模拟物并被分别公布于美国专利号6，664，230和6，933，279以及W02004/034977中。每个此类肽包含18氨基酸序列，即D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(Ac-Asp-Trp-Phe-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Va1-Ala-Glu-Lys-Phe-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2-SEQIDN01)，具有乙酰基氨基末端保护基团和一个酰胺羧基末端保护基团。在游离(非结合)形式中，当所有氨基酸都处于D型时，该肽已知为APP018;当所有氨基酸都处于L型时，该游离(非结合)肽被称为APL180。这些肽含有四个苯丙氨酸，当所有氨基酸都处于D型时，有时被称为"D4F"，或当所有氨基酸都处于L型时有时被称为"L4F"。反式"L4F"是4F的镜像，其中各氨基酸之间的相对位置及氨基酸与亲水面和疏水面间的相互位置不变。类似地，此组中的肽包括两个苯丙氨酸，被称为2F;三个苯丙氨酸，被称为3F;五个苯丙氨酸，5F;六个苯丙氨酸，6F及七个苯丙氨酸或7F。也可以有基于这些肽的镜像或反式肽。所有这些肽被显示可抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化，剌激胆固醇的逆行转运，以及降低粥样硬化病变的形成。因而，这些活性剂在治疗特别是在美国和西欧国家仍为发病率和死亡率主要原因的心血管疾病中有用。因此，这些肽的有效制剂是非常需要的。包括即oA-I的可交换脱脂载脂蛋白拥有脂结合域(Brouillette等人，Biochim.Biophys.Acta1256:103-129(1995);Segrest等人，FEBSLett.38::247-253(1974))。ApoA-I被假定拥有8个串联重复的22mer序列。A类两亲螺旋的特征包括在极性-非极性交界面存在带正电残基以及在极性面中心存在带负电残基(Id.;Segrest等人，Proteins:Structure,Function,andGenetics8:103—117(1990))。已显示ApoA_I与磷月旨强力结合形成复合物从而促进胆固醇从富含胆固醇的细胞中流出。现在已显示即o-A的二级结构对于与脂的高亲和力结合至关重要，最终导致其生物活性(Saito等人，J.Biol.Chem.279(20):20974-20981(2004))。因此，保存即oA_I的二级结构是很需要的。在不将本发明局限于特定作用机制的情况下，保存a-螺旋的构象可能是必需的因为它对于赋予即o-I其结合脂的亲和力是重要的。美国专利号.6，664，230的发明提供了包含18个氨基酸的新型肽，其以"D"氨基酸残基制备时具有A类两亲螺旋和/或具有受保护的氨基和羧基端，当其通过口服施用于生物时，易于被摄取并被运送到血清中，它对于缓和动脉粥样硬化的一种或多种症状有效。冷冻干燥蛋白是提高蛋白化学和物理稳定性的常用手段。然而，冷冻和脱水压力可引起蛋白聚集，导致丧失其生物活性。海藻糖，a-D-吡喃葡糖基-a-D-吡喃葡萄糖苷是天然产生的二糖，它被显示在预防干燥过程中的蛋白质及其他大分子、病毒和食品的变性中有用。参见，例如美国专利号.4，891，319，5，149，653，5，026，566，5，902，565和6，890，512。EP0762897虽指出其公开的预防聚集的方法适用于蛋白和肽，但仅以人类生长激素例证了其方法。海藻糖还作为蛋白质稳定剂在文献中被广泛研究(Kaushik等人，J.Bio.Chem.278(29):26458-26465(2003))。目前为止，没有海藻糖在保存肽二级结构中有效的建议被记载在已有技术中。因而，用海藻糖在冷冻干燥过程中保存APP018和APL180的a-螺旋(二级)结构的方法将为所需要的。发明概要本发明涉及在冷冻干燥过程中保存肽的二级结构的方法，此方法包含以下步骤(a)将海藻糖与肽在溶液中混合，此海藻糖的量足以保存肽的二级结构；及(b)冷冻干燥此溶液或悬浮液以获得二级结构得到保存的肽组合物，其中的肽选自N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺(D4F);N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺(L4F)、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。在本发明此方面的优选实施方案中，肽为L4F。本发明进而涉及进一步包含以下步骤的方法(c)重构此肽组合物从而得到此肽的溶液或悬浮液，其中二级结构得到保存。在本发明某些优选实施方案中，二级结构是a-螺旋结构。在另外的优选实施方案中，步骤(a)的溶液或悬浮液还包含至少一种额外的冷冻干燥赋形剂，例如缓冲液或表面活性剂。本发明还涉及依据本发明的方法制备的冷冻干燥并重构的组合物。本发明仍进一步涉及包含肽及含量足够保存此肽二级结构的海藻糖的冷冻干燥组合物，其中所述肽选自N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。发明详述本发明涉及在冷冻干燥过程中保存肽二级结构的方法。如此处所用，"二级结构"指生物分子(例如肽)或生物分子(例如蛋白质和核酸)片段的一般三维形态；为本发明的目的，"二级结构"优选地指某些肽的a-螺旋结构。如此处所用，"保存"(及其其它形式)是指保持完整。保存优选地指保持或改善(提高)某些肽的a-螺旋含量-换而言之，根据本发明的方法制备的特定冷冻干燥组合物的a-螺旋含量比根据传统过程制备的冷冻干燥组合物要高。如此处所用，"冷冻干燥"(及其其它形式)指任意从材料中去除水的过程，此材料先被冷冻，然后经过降低的压力和/或加热以允许水分直接从固相升华为气态。更具体地，本发明的第一个实施方案包含以下步骤(a)将海藻糖与肽在溶液或悬浮液中混合，此海藻糖的量足以保存肽的二级结构及(b)冷冻干燥此溶液或悬浮液以获得二级结构得到保存的肽合物，其中所述肽选自N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。优选地，此肽为游离形式的N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺。单独的肽此处一般指本发明的肽。在发明方法的第一步中，海藻糖与本发明的肽在溶液中混合。海藻糖为商业上可得的材料并可从任意来源购得。N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺肽或本发明的任意肽可从商业来源购得或根据美国专利号6，664，230和6，933，279及PCT国际公开号W02004/034977描述的已知过程制备，上述每个文献的整个公开都在此通过援引而并入。海藻糖和本发明的肽在水中混合。根据本发明，海藻糖可被加入到本发明的肽溶液中，肽可被加入到海藻糖溶液中或者海藻糖和肽可被加入到溶剂中以形成步骤(a)中的溶液。pH值被调整到大约3至11的范围中，更优选地为6至9，甚至更优选地为6.5至9。优选地，包括但不局限于TWEEN80的表面活性剂在加入肽之前被添加。TWEEN80的存在量的范围优选地为从约0.0001%至约10%的容重。足够保存肽的二级结构的海藻糖量对应的范围优选地为从大约1至大约50%，更优选地容重为从大约10至25%，最优选的容重为约10%。与之对应的海藻糖与肽的重量比的范围为从约500:o.oi至约io:200，优选地为从约250:o.2至约i00:30，最优选地为约ioo:o.2至约i00:30。混合可通过任意传统方式完成，即，简单混合。在本发明的优选实施方案中，步骤(a)的溶液还包含至少一种额外的缓冲液。适用于本发明的缓冲液包括但不局限于，磷酸钠，例如磷酸二氢钠或磷酸二钠，磷酸钾，Tris，柠檬酸盐，酒石酸盐和组氨酸及其组合。当其存在时，磷酸盐缓冲液的浓度对应的范围优选地为从步骤(a)的溶液的约lmM至约1M，优选地为从约5mM至约100mM。在本发明方法的第二步中，冷冻干燥溶液或悬浮液以得到二级结构被保存的肽组合物。冷冻干燥可以通过任意已知方式完成。例如，冷冻干燥可涉及使用冷冻干燥瓶，所述冷冻干燥瓶在浴锅中旋转，通过机械制冷、干冰及甲醇或液氮冷却，或者所述冷冻干燥可涉及使用大规模冷冻干燥机。冷冻干燥海藻糖和肽的组合的结果是肽组合物中肽的二级结构将被保存。换而言之，步骤(b)的肽组合物与未使用海藻糖的冷冻干燥肽组合物相比具有较高a-螺旋含量。本发明第一个实施方案的任选步骤包含(c)重构肽组合物从而得到二级结构被保存的肽溶液。重构可通过例如向步骤(b)的肽组合物中简单添加水的任意已知方式完成。本领域普通技术人员将易理解，不同肽浓度的溶液可通过以不同量的溶剂重构得到。适用于步骤(c)的溶剂包括但不局限于水、缓冲液或等渗溶液。重构冷冻干燥肽组合物的结果是肽的二级结构将被保存。换而言之，步骤(c)的溶液与由未使用根据本发明的海藻糖的冷冻干燥肽组合物重构而得的溶液或悬浮液相比具有较高的肽二级结构含量，并可能地6具有较高a-螺旋含量。本发明另外的实施方案涉及根据本发明第一个实施方案的方法制备的冷冻干燥组合物和重组组合物。本发明的另一个实施方案涉及包含肽和含量足以保存肽的二级结构的海藻糖的冷冻干燥组合物，所述肽为N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。关于肽及海藻糖量的细节与上文关于本发明第一个实施方案所记载的相同。本发明具体实施方案现在将通过援引以下实施例显示。应理解这些实施例仅为阐释本发明而公开，它们不应以任何方式限制本发明的范围。实施例1N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺(APL180)的冷冻干燥组合物用下表l所记成分制备。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>此为冷冻干燥前的每毫升组合物。制剂1和3为lmg/mlAPL180制备，制剂2和4为100mg/mlAPL180制备。两种浓度皆包含15mM，pH7的磷酸盐缓冲液及10%海藻糖。制剂3和4还包含0.5%的TWEEN80。制备lmg/mlAPL180溶液，每瓶加入lml，冷冻干燥，并于使用前用lml水重构。lOOmg/mlAPL180制剂以25mg/mlAPL180溶液制备，每瓶加入2ml，冷冻干燥，并于使用前用0.5ml水重构。因此，25mg/mlAPL180溶液中的其它成分被配制为重构后所需的25%的终浓度。冷冻干燥循环如下进行表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2用傅立叶变换红外光谱法研究冷冻干燥重构溶液N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺(APL180)的冷冻干燥组合物用下表3所记成分制备然后如所记重构并用傅立叶变换红外光谱法检测以确定％a和％P螺旋。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例36mgN-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺组合物配制6mgAPL180药物产品作为无菌的冷冻干燥粉末用于静脉内施用。每瓶的组合物在表4中提供。每瓶在冷冻干燥前用2.2ml总体溶液过度充满并于施用前以2ml注射用水(WFI)重构。两毫升重构溶液将递送6mgAPL180。表4.6mg/瓶APL180药物产品组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>參初步包装组成部分O拉制玻璃瓶6ml/20mm反吹O橡皮塞20mmDaikyoD777-l，V10-F7-3WB2-TRlyo，RSO铝塑易拉盖(flipoff)PP/AL20mm天然/天然參散装液体制剂组成在装瓶及冷冻干燥前，APL180被制为散装液体。散装液体制剂的组成在表5中提供。表5冷冻干燥前APL180散装液体制剂的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>制备程序制备APL180所制散装溶液(配料)l检视配料区及槽/容器(SST316L)的清洁。2获得配料容器皮重。3计算加入配料容器中WFI的量(约为最终制剂总体积的80%)。4将所计算量的冷WFI加入配料容器中。5启动推进式混合器，调节速度至中度混合。加入称量量的a.无水磷酸氢二钠b.磷酸二氢钠2Aqc.海藻糖二水合物d.多乙氧基醚APL180在a、b、c和d完全溶解前将不被加入。混合至少15分钟。若未溶解，继续混合至视觉检视已溶解。e.APL1806加WFI至满批量的98X。取样测pH。根据需要，用l.ON注射用氢氧化钠或lN盐酸调节pH。7用WFI补足至满批量并混合至少五(5)分钟。8取样用于外观、密度和pH的IPC测试。9用混合的溶液测试两个0.22iiPVDF滤器(根据批量大小Millipak40或Millipak20)的完整性。丢弃所有用于完整性测试的溶液。产品特别BPmin=38.5psil0将混合的溶液过滤通过完整性得到测试的滤器。丢弃通过第二个滤器的最初500ml溶液。冷冻干燥APL180制剂11.在无菌条件下将2.2ml从步骤10制备的散装溶液灌入干净无菌的6ml瓶中。丢弃最初的230瓶(相当于506ml溶液)。12.将DaikyoD777-1lyo橡皮塞部分插入瓶中。13.将小瓶装入冷冻干燥机中。14.按照表6中的步骤开始冷冻干燥循环。15.在循环结束时，用氮气回填冷冻干燥室使室内最终压力为850士50mbar。然后将小瓶完全封塞。16.将检视过的瓶子盖上铝塑易拉密封盖(Alumi皿mFlipOffseal)。表6冷冻干燥循环参数<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>虽然本发明援引具体实施方案如上描述，但是显然可做许多更改、修饰和变化而不偏离此处公开的发明概念。因而，意欲包括在所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类更改、修饰及变化。所有此处引用的专利申请，专利及其它公开出版物均以其整体通过援引而并入。权利要求在肽的冷冻干燥过程中保存二级结构的方法，其包括以下步骤(a)将海藻糖与肽在溶液或悬浮液中混合，所述海藻糖的量足以保存肽的二级结构；及(b)冷冻干燥所述溶液或悬浮液以获得其中二级结构得到保存的肽组合物，其中所述肽选自N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。2.权利要求l的方法，其中所述肽为N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酷胺或其任意可药用盐形式。3.权利要求1的方法，其进一步包含以下步骤(c)重构所述肽组合物从而得到在其中二级结构得到保存的肽溶液。4.权利要求3的方法，其中所述肽为N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酷胺或其任意可药用盐形式。5.权利要求l的方法，其中所述二级结构为a-螺旋结构。6.权利要求3的方法，其中步骤(b)或(c)的肽组合物具有高a-螺旋含量。7.权利要求l的方法，其中海藻糖与肽的重量比范围为从约500:O.Ol至约10:200，所述重量比提供了足以保存二级结构的海藻糖的量。8.权利要求7的方法，其中海藻糖与肽的重量比范围为从约100:0.2至约100:30。9.权利要求1的方法，其中步骤(a)的溶液进一步包含至少一种额外的赋形剂。10.权利要求9的方法，其中所述至少一种额外的赋形剂选自表面活性剂和缓冲液，及其组合。11.权利要求10的方法，其中所述表面活性剂在肽之前被加入。12.权利要求11的方法，其中所述表面活性剂为TWEEN80.13.权利要求12的方法，其中TWEEN80以下述量存在，所述量范围以容重计为步骤(a)的溶液的约O.0001至10%。14.权利要求13的方法，其中TWEEN80以下述量存在，所述量范围以容重计为步骤(a)的溶液的约O.005至0.1%。15.权利要求10的方法，其中所述缓冲液选自磷酸钠、磷酸钾、Tris、柠檬酸盐、酒石酸盐和组氨酸。16.权利要求15的方法，其中所述缓冲液为磷酸钠缓冲液，其以下述量存在，所述量的范围为步骤(a)的溶液的约5mM至100mM。17.根据权利要求l的方法制备的冷冻干燥组合物。18.根据权利要求3的方法制备的重构组合物。19.冷冻干燥组合物，其包含肽以及足以保存肽的二级结构的量的海藻糖，所述肽选自N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺；N_乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺、D3F、L3F、D5F、L5F、D6F、L6F、D7F和L7F或其任意可药用盐形式。20.权利要求19的冷冻干燥组合物，其中所述肽为N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺或者N_乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺。21.权利要求20的冷冻干燥组合物，其中所述肽为N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺。全文摘要公开了保存N-乙酰基-D-Asp-D-Trp-D-Phe-D-Lys-D-Ala-D-Phe-D-Tyr-D-Asp-D-Lys-D-Val-D-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Phe-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Phe-酰胺或者N-乙酰基-L-Asp-L-Trp-L-Phe-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Tyr-L-Asp-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Phe-L-Lys-L-Glu-L-Ala-L-Phe-酰胺的α-螺旋二级结构的方法以及包含此类肽的组合物。文档编号A61K47/26GK101730548SQ200880023535公开日2010年6月9日申请日期2008年7月9日优先权日2007年7月9日发明者F·刘,T·布拉纳肖克派森申请人:诺瓦提斯公司