利用多肽介导的dna纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，将具备一定功能的多肽连接在DNA纳米结构上，所制备的产物为DNA纳米结构与多肽的复合物，DNA纳米结构表面负载生物分子后与细胞相互作用时，特定功能的多肽能介导负载生物分子的DNA纳米结构进入细胞或特异性地与细胞表面的受体结合，实现DNA结构用作抗肿瘤药物载体的目的。在抗肿瘤药物载体的开发、研究及提高抗肿瘤药物载体的载入效率等方面具有潜在的应用价值。
【专利说明】利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料功能化及应用领域,涉及一种通过多肽介导,DNA纳米结构可将负载的生物分子高效载入细胞的技术；构建的生物复合结构可用于新型高效抗肿瘤药物载体的开发及研究。
【背景技术】
[0002]癌症已经超越心脑血管疾病，成为危害人类生命的头号敌人。随着肿瘤发病率的日趋升高，人们对癌症诊断 和治疗的研究也在不断加深。目前已经形成一些共识，包括:对于多种恶性肿瘤组织和细胞，准确可靠的早期诊断比较困难；当前的抗癌药物因生物相容性问题存在严重的毒副作用；体内多变环境也限制了抗癌药物的应用等。因此，如何实现诊断探针及治疗药物特异性地进入癌细胞，并且能实现低毒和高效的诊治是亟待解决的生命科学问题。新型的纳米材料以及结构的制备与应用不仅给纳米技术注入了新的活力，也给抗肿瘤药物的研究及发展起了巨大的推动作用。目前利用纳米颗粒或纳米结构作为抗肿瘤药物载体进行抗肿瘤的研究中，使用较多的如高分子纳米材料、脂质体以及金属纳米粒子等，并且已有很多纳米药物运载系统成功应用的先例，但不可否认的是，在药物的高效负载、靶向输运、集治疗和检测于一体的多功能药物载体的研究里关于仍然存在诸多问题，t匕如脂质体的粒径分布可能影响载体进入细胞的效率，另外一些金属纳米粒子存在生物安全方面的争议等。因此，近几年国际上基于DNA分子进行设计的纳米生物复合结构，成为新一代的抗肿瘤药物载体的相关研究备受瞩目。在充分利用和发展纳米技术特有的优势的基础上，有望基于DNA纳米结构制备高效、靶向、低毒及多功能的纳米生物复合结构作为抗肿瘤药物载体从而促使药物发挥更为高效作用，为抗肿瘤研究工作累计理论基础和实践经验。但同时也不可忽略的是，目前所制备的DNA纳米结构尺寸较大，较难直接作为抗肿瘤药物载体运载药物分子进入细胞，因此，本发明通过多肽介导，可实现DNA纳米结构可将负载的生物分子高效载入细胞。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术的不足，本发明提供一种多肽介导的DNA纳米结构实现生物分子高效载入细胞的新方法，可将生物分子负载于DNA纳米结构上，在多肽的介导下，可以特异性地与细胞表面受体作用；或在穿膜肽的作用下，将药物分子载入肿瘤细胞，从而实现治疗的目的。在抗肿瘤药物载体的开发、研究及提高抗肿瘤药物载体的载入效率等方面具有潜在的应用价值。
[0004]一种利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，将具备一定功能的多肽连接在DNA纳米结构上，所制备的产物为DNA纳米结构与多肽的复合物，DNA纳米结构表面负载生物分子后与细胞相互作用时，特定功能的多肽能介导负载生物分子的DNA纳米结构进入细胞或特异性地与细胞表面的受体结合，实现DNA结构用作抗肿瘤药物载体的目的；其中所述的DNA纳米结构，由DNA通过自组装、延伸、折叠等技术构成的一类纳米结构，组成此结构的单链DNA，可经过如巯基、生物素、或氨基等修饰。
[0005]多肽介导的DNA纳米结构的制备包括以下几个步骤:
(1)长链DNA溶液中中，加入订书钉链DNA，高温下混合均匀后缓慢降至室温；
(2)向(I)步骤所得产物中，加入生物分子，混合均匀后水浴中连接；
(3)向(2)步骤所得产物中，加入多肽溶液，混合均匀后水浴中连接；
(4)将(3)步骤所得的产物加入到到细胞培养皿中，370C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中与细胞共培养；
(5)细胞用缓冲液洗涤后，将细胞用多聚甲醛或甲醛固定；
(6)细胞用缓冲液洗涤后，用荧光染料将细胞核染色；
(7)激光共聚焦荧光显微镜观察内部具有量子点荧光的细胞。
[0006]步骤(1)所述长链DNA为合成的长链DNA、噬菌体M13、经过滚环扩增技术所得的长单链DNA中的一种；所述订书钉链DNA，为多条能与长链DNA互补杂交的单链DNA，可经过疏基、氣基、生物素修饰。
[0007]步骤(1)所述高温为95°C，室温25°C，降温时间为12小时以上。
[0008]步骤(2)所述生物分子为亲和素、链霉亲和素、量子点、荧光分子、纳米粒子、DNA、RNA、多肽、小分子药物中的一种；其中量子点发射波长为560、580、600、620、640nm。
`[0009]步骤(2)所述生物分子连接条件为37°C水浴，30分钟以上。
[0010]步骤(3)所述多肽是由氨基酸构成的功能性蛋白质，具体为穿膜肽、与细胞表面受体结合的功能性多肽。
[0011]步骤(3)所述与多肽连接条件为室温30分钟以上。
[0012]步骤(3 )所述多肽通过静电吸附作用方式连接在DNA纳米结构上。
[0013]步骤(4)所述细胞为肿瘤细胞、吞噬模型细胞或表面有表达受体可与所用多肽相作用的细胞。
[0014]可利用共聚焦荧光显微镜对复合物与细胞的作用进行表征和观察，此技术构建的纳米生物复合结构可用于新型抗肿瘤新型药物载体的研制及药物载体负载效率的提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1激光共聚焦荧光显微镜下细胞成像，自上而下依次为:对照组，细胞只经过固定染色后成像；亲和素-量子点与穿膜肽混合后与细胞作用后染色成像；DNA纳米结构与亲和素-量子点连接后产物与细胞作用后染色成像；DNA纳米结构与亲和素-量子点、细胞穿膜肽连接后产物与细胞作用后染色成像。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 环 DNA(2μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10Χ)，phi29 polymerase 4yL,10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30°C，水浴中扩增30min。所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 μ L，加入milliQ水12 μ L，加入订书链1_3(100μΜ，序列依次为:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5，-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3，
5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 缓冲液(10 X，125mMMg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。10 μ L产物稀释到90 ULMill1-Q水中，取5μ L滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
[0017]实施例2:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 环 DNA(2μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10Χ)，phi29 polymerase 4yL, 10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30°C水浴中扩增30min。所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 μ L，加入milliQ水12 μ L，加入订书链1_3(100μΜ，序列依次为:
5，CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3，
5，CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3，
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，其中订书钉 2 的 5’为生物素修饰)各 I μ L,2 μ L TAE缓冲液(10X，125mM Mg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。18 μ L产物中加入2 μ Llmg/mL链霉亲和素后，37°C水浴中连接2h后。连接后产物稀释10倍后，取5 μ L滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Mi I I1-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
[0018]实施例3:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 环 DNA(2μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10Χ)，phi29 polymerase 4yL, 10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30°C水浴中扩增30min。所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 μ L，加入milliQ水12 μ L，加入订书链1_3(100μΜ，序列依次为:
5，CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3，
5，CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3，
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，其中订书钉 2 的 5’为生物素修饰)各 I μ L,
2μ L TAE缓冲液(10X，125mM Mg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。18 μ L产物中加入2 μ LI μ M亲和素-量子点后，37°C水浴中连接2h后。连接产物中加入细胞培养100 μ L后混合均匀加入到细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中与细胞作用2小时后150 μ LPBS洗涤液洗涤后，加入4%多聚甲醛固定30min，后PBS再次洗涤，加入120 μ LDAPI进行细胞核染色，PBS洗涤，激光共聚焦荧光显微镜下成像。
[0019]实施例4:1mL 15nm金胶溶液中加入20 μ L (100 μ Μ) SH-DNA，室温振荡过夜后加入IOOmMPBbuffer (pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液(10 mM PB, 2M NaCl, pH 7.4)溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4°C 12000rpm/min，15min，离心洗涤3次后，沉淀物于200 uL, pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重悬浮，4°C保存。16yLAu-引物 DNA (ΙμΜ，序列为 5，CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ Lif DNA(2μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10Χ), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30° C 水浴中扩增30 min。所得产物在4° C, 5000 rpm/min下离心5min,小心去除上清后加入20 μ LmilliQ水重悬浮。取此产物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入订书链1-3 (ΙΟΟμΜ,序列依次为:
5，CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3，
5， CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3，
5，TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3 ’)各 I μ L，2 μ L TAE 缓冲液(10 X，125mMMg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95° C后梯度降温至25。C。IOyL产物稀释到90 ULMill1-Q水中，取5μ L滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
[0020]实施例5:
ImL 15nm金胶溶液中加入20 μ L (ΙΟΟμΜ) SH-DNA，室温振荡过夜后加入IOOmMPBbuffer (pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液(10 mM PB, 2M NaCl, pH 7.4)溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4°C 12000rpm/min，15min，离心洗涤3次后，沉淀物于200 uL, pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重悬浮，4°C保存。16yLAu-引物 DNA (ΙμΜ，序列为 5，CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L if DNA(2 μ M，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10Χ)，phi29 polymerase 4yL,10 U/μ L)，混合溶液终体积为40 μ L。然后30°C水浴中扩增30 min。所得产物在4°C, 5000 rpm/min下离心5min,小心去除上清后加入20 μ LmilliQ水重悬浮。取此产物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入订书链1-3 (100 μ Μ，序列依次为:
5，CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3，
5，CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3，
5，TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3 ’，其中订书钉 2 的 5 ’ 为生物素修饰)各I μ L，2 μ L TAE缓冲液(10 X，125mM Mg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。18 μ L产物中加入2 μ Llmg/mL链霉亲和素后，37°C水浴中连接2h后。连接后产物稀释10倍后，取5μ L滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
[0021]实施例6:ImL 15nm金胶溶液中加入20 μ L (ΙΟΟμΜ) SH-DNA，室温振荡过夜后加入IOOmMPBbuffer (pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液(10 mM PB, 2M NaCl, pH 7.4)溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4°C 12000rpm/min，15min，离心洗涤3次后，沉淀物于200 uL, pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重悬浮，4°C保存。16yLAu-引物 DNA (ΙμΜ，序列为 5，CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3 ’)中依次加入 12 μ Lif DNA(2μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X)，phi29 polymerase 4yL,10 U/μ L)，混合溶液终体积为40 μ L。然后30°C水浴中扩增30 min。所得产物在4°C, 5000 rpm/min下离心5min,小心去除上清后加入20 μ LmilliQ水重悬浮。取此产物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入订书链1-3 (100 μ Μ，序列依次为:
5，CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3，
5，CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3，
5，TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3 ’，其中订书钉 2 的 5 ’ 为生物素修饰)各luL,2yL TAE缓冲液(10X，125mM Mg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。18 μ L产物中加入2 μ Llmg/mL链霉亲和素，37°C水浴中连接2h后。连接产物中加入细胞培养100 μ L后混合均匀加入到细胞培养皿中，37°C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中与细胞作用2小时后150 μ LPBS洗涤液洗涤后，加入4%多聚甲醛固定30min，后PBS再次洗涤，加入120 μ LDAPI进行细胞核染色，PBS洗涤，激光共聚焦荧光显微镜下成像。`
【权利要求】
1.一种利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，将具备一定功能的多肽连接在DNA纳米结构上，所制备的产物为DNA纳米结构与多肽的复合物，DNA纳米结构表面负载生物分子后与细胞相互作用时，特定功能的多肽能介导负载生物分子的DNA纳米结构进入细胞或特异性地与细胞表面的受体结合，实现DNA结构用作抗肿瘤药物载体的目的； 其中所述的DNA纳米结构，由DNA通过自组装、延伸、折叠等技术构成的一类纳米结构，组成此结构的单链DNA，可经过如巯基、生物素、或氨基等修饰。
2.根据权利要求1所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，多肽介导的DNA纳米结构的制备包括以下几个步骤: (1)长链DNA溶液中中，加入订书钉链DNA，高温下混合均匀后缓慢降至室温； (2)向(I)步骤所得产物中，加入生物分子，混合均匀后水浴中连接； (3)向(2)步骤所得产物中，加入多肽溶液，混合均匀后水浴中连接； (4)将(3)步骤所得的产物加入到到细胞培养皿中，370C，5.0% 二氧化碳的细胞培养箱中与细胞共培养； (5)细胞用缓冲液洗涤后，将细胞用多聚甲醛或甲醛固定； (6)细胞用缓冲液洗涤后，用荧光染料将细胞核染色； (7)激光共聚焦荧光显微镜观察内部具有量子点荧光的细胞。
3.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(1)所述长链DNA为合成的长链DNA、噬菌体M13、经过滚环扩增技术所得的长单链DNA中的一种；所述订书钉链DNA，为多条能与长链DNA互补杂交的单链DNA，可经过疏基、氣基、生物素修饰。
4.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(1)所述高温为95°C，室温25°C，降温时间为12小时以上。
5.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(2)所述生物分子为亲和素、链霉亲和素、量子点、荧光分子、纳米粒子、DNA、RNA、多肽、小分子药物中的一种；其中量子点发射波长为560、580、600、620、640nm。
6.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(2)所述生物分子连接条件为37°C水浴，30分钟以上。
7.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(3)所述多肽是由氨基酸构成的功能性蛋白质，具体为穿膜肽、与细胞表面受体结合的功能性多肽。
8.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(3)所述与多肽连接条件为室温30分钟以上。
9.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(3)所述多肽通过静电吸附作用方式连接在DNA纳米结构上。
10.根据权利要求2所述利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤(4)所述细胞为肿瘤细胞、吞噬模型细胞或表面有表达受体可与所用多肽相作用的细胞。
【文档编号】A61K47/26GK103656662SQ201310607898
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】颜娟, 宋世平, 樊春海, 金彩虹, 何丹农 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司