一种基因疫苗载体、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因疫苗载体、其制备方法及应用，该基因疫苗载体是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I）所示：，其中，m=1时，n=0、1、2或3；n=1时，m=1、2或3。该基因疫苗载体负载DNA后的免疫原性强、负载量大、没有明显毒性并可注射免疫。本发明的基因疫苗载体制备条件温和并且过程简单。
【专利说明】一种基因疫苗载体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种基因疫苗载体、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)已经引起超过3 千万人的死亡，发展一种高效的疫苗防止HIV的感染成为人们迫切的需要。除此之外， 譬如乙肝、丙肝以及流感等传统的疫苗的效率很低并会引来潜在的风险，所以安全的替 代物如基因疫苗引起广泛的注意。基因疫苗十分安全并且可以产生长期的细胞免疫 和体液免疫应答，但是基因疫苗的免疫原性很低，需要通过一种载体输送到体内增强 免疫应答。已有的载体包括高分子、脂质体以及纳米或微米颗粒等。高分子如聚醚酰 亚胺（Polyetherimide，PEI)具有较大的毒性（Lim，M.H.，et al. (2007). Accounts of chemical research40(l) :41-51);脂质体的抗原负载量比较小（Malmsten，M. (2006). Soft matter2 (9) :760-769.);纳米或微米颗粒如二氧化硅小球或微乳液制备复杂，在制备过程 中存在的有机溶剂、高剪切力及超声等条件易使DNA活性下降（Ando, S.，et al. (1999). Journal of Pharmaceutical Sciences88(I) : 126-130 ；ffalter, E. , et al. (1999). Journal of Controlled Release61(3) :361-374 ；Gemeinhart,R.A.,et al. (2005). Biotechnology Progress21 (2) :532-537.)。水凝胶虽然具有比较好的生物相容性，但是传统的水凝胶不 可直接注射使用，需要原位成胶用于载药，虽然可局部释药，但是未反应的单体会造成毒性 (Altunbas，A.，et al. (2011).Biomaterials32(25):5906-5914·)。因此，如何找到一种安 全、高效负载、制备简单且不降低疫苗活性、可注射的基因疫苗载体仍然是一个挑战。
[0003] 超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子通过自组装在水溶液中形成的水凝 胶（Aida，T.，et al. (2012).Science335(6070):813-817·)。这种水凝胶成胶方法多样， 可快速对pH、离子强度及温度等进行响应，形成水凝胶（Hartgerink, J. D.，et al. (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences99 (8) :5133-5138.)。在这些方法 中，酶催化的成胶反应具有独特的优点，具有高选择性，可在生理条件下或者温和条件下快 速成胶，从而避免了 DNA 生物活性的降低（Yang, Z.，et al. (2008) .Accounts of chemical research41 (2) :315-326.)。此外超分子水凝胶可以多种方式注射到体内，皮下或腹腔给动 物注射超分子水凝胶均没有显示出急性或长期毒性（Yang, Z.，et al. (2006). Journal of the American Chemical Societyl28 (9):3038-3043. )〇
[0004] 中国专利申请（申请号为：200910229186. 7)涉及一系列用于生成稳定小分子水凝 胶的多肽衍生物的合成方法，但是没有涉及这种小分子水凝胶的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明人通过大量实验和创造性劳动，制得了一种基因疫苗载体，并证实该基因 疫苗载体负载DNA后的免疫原性强、负载量大、没有明显毒性并可注射免疫。本发明的基因 疫苗载体制备条件温和并且过程简单。本发明可通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方 式对人或动物进行HIV、乙肝、丙肝和流感病毒等病毒的免疫。
[0006] 本发明采用以下技术方案：
[0007] 在第一方面，本发明提供一种基因疫苗载体，其是磷酸酶催化小分子多肽形成的 超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I)所示：
[0008]
【权利要求】
1. 一种基因疫苗载体，其特征在于，所述基因疫苗载体是磷酸酶催化小分子多肽形成 的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I)所示：
其中，m=l时，n=0、l、2 或 3 ;n=l时，m=l、2 或 3。
2. 根据权利要求1所述的基因疫苗载体，其特征在于，所述小分子多肽的结构式如式 (II)所示：
根骷仪利安豕i玫^所还的*囚没田顼1平，兵狩他仕卞，所还塒酸職刃侧a王塒酸職玫 酸性磷酸酶。
4. 一种权利要求1至3任一项所述的基因疫苗载体的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤： (a) 使用Tris缓冲液作为溶剂配置磷酸酶溶液； (b) 使用PBS缓冲液作为溶剂配置小分子多肽溶液，调节pH5?9 ; (c) 将所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均匀，至所述小分子多肽的浓度 (w/v)为0. 8%。以上，静置以形成超分子水凝胶，即所述基因疫苗载体。
5. 根据权利要求4所述的基因疫苗载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中，所 述Tris缓冲液为50mMTris-HCl+lmMMgCl2溶液，所述磷酸酶为碱性磷酸酶，所述碱性磷 酸酶的浓度为2U/iiL; 所述步骤（b)中，所述小分子多肽的结构式如所述式（II)所示，所述小分子多肽溶液 的浓度为2%。，用Na2C03调节pH至9 ; 所述步骤（c)中，所述磷酸酶溶液与所述小分子多肽溶液的体积比为3 :100,所述静置 为室温静置lOmin以上。
6. -种负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的基 因疫苗载体及所述基因疫苗载体负载的DNA。
7. 根据权利要求6所述的负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，所述DNA包含HIV、 乙肝、丙肝和流感病毒中一种或至少两种病毒的蛋白质编码序列。
8. -种权利要求6或7所述的负载有DNA的基因疫苗载体的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 使用Tris缓冲液作为溶剂配置磷酸酶溶液； (2) 使用PBS缓冲液作为溶剂配置小分子多肽溶液，调节pH5?9,并加入所述DNA; (3) 将所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均匀，至所述小分子多肽的浓度 (w/v)为0. 8%。以上，静置以形成超分子水凝胶，即所述负载有DNA的基因疫苗载体。
9. 一种权利要求6或7所述的负载有DNA的基因疫苗载体作为基因疫苗的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体为将所述负载有DNA的 基因疫苗载体作为基因疫苗，通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方式对人或动物进行 HIV、乙肝、丙肝和流感病毒中一种或至少两种病毒的免疫。
【文档编号】A61P31/14GK104274839SQ201310271890
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月1日 优先权日:2013年7月1日
【发明者】蒋兴宇, 田月, 杨志谋, 王怀民, 邵一鸣 申请人:国家纳米科学中心