一种质粒传递载体的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种可将质粒吸附于表面的传递载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]质粒是一种在细菌和酵母中自然存在的小的双链DNA环状分子，它们以独立的单位进行复制。虽然只占据了宿主细胞总DNA的一小部分，但却带有重要的基因。正由于质粒DNA较小，并带有抗性基因，使之在重组DNA技术中得到广泛的应用。
[0003]质粒DNA运输载体的研宄一直困扰各国科学家，成为基因治疗成败的关键问题。人们一直致力于寻找合适的载体材料能有效地将质粒DNA输送到革E细胞，并在一定时间内维持其功效。随着纳米生物技术的飞跃发展，纳米基因载体作为一种非病毒型基因载体，虽然转染率低于病毒载体，但是却具有免疫原性低、低毒、装载容量大、制备简单等优点。纳米颗粒的呈递体系具有靶向传递的潜能，有很好的稳定性和生物相容性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是纳米颗粒通过增加渗透和滞留效应(EPR效应)可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器。另外，具有良好生物相容性的可降解纳米基因载体能有效保护质粒DNA分子，使质粒DNA在细胞质中迅速释放，实现阻断基因表达的目的，这将使这类载体在质粒DNA给药中具有更好的优势和应用前景。以纳米颗粒为基础的非病毒纳米传递载体可分为使用有机材料制备和使用无机材料制备。目前最常见的有纳米树、聚氰基丙烯酸异丁酯和聚乳酸、烷化硅纳米颗粒等。将这些载体分子与含有质粒的溶液互混得到二者的复合物，从而实现呈递质粒DNA达到治疗效果的目的。然而，这类方法不易放大规模且重复性较差。
[0004]海泡石(sep1lite)是一种富镁纤维状娃酸盐粘土矿物，属特种稀有非金属矿，有“软黄金”之称，具有丝絹光泽，有时呈蜡状光泽，莫氏硬度2-2.5级，密度1-2.2g/cm3，可塑性好，可溶于盐酸。由于海泡石具有特殊构造，使其保留着一系列晶道，因而具有极大的比表面积，按海泡石晶体结构模型，从理论上计算，海泡石的外比表面积可达400m2/g，内比表面积可达500m2/g，故有极强的吸附性，脱色性和分散性。海泡石基本结构式属链状结构，结构中所构成的开式沟枢与晶体长轴平行，因而这种沟枢的吸附性能极强，这也是海泡石成为该族矿物中具有最佳性能和最广泛用途的关键所在。海泡石也因具有的独特物理化学性质而广泛地应用于各个领域中。海泡石可以实现质粒对细胞的转化；这种介质对人体健康友好，无致癌物质；其本身无生物活性，不会对宿主生长产生影响；操作过程中不需特殊的设备；不需要感受态的制备就可以得到较高的转化率。但是，一般情况下，海泡石原矿品位低，杂质成分繁杂且不稳定，提纯工艺相对比较复杂。
[0005]蒙脱石(MMT)又叫膨润土，是一种矿物药。据记载我国蒙脱石的药用已有悠久历史，唐代医学名著《本草拾遗》中的干土即为蒙脱石。国内的蒙脱石资源丰富，自20世纪80年代开始被欧美国家制做药用赋形剂，并分别纳入美国、欧洲和英国药典。蒙脱石系由氧化硅及氧化铝组成的不溶性层状硅酸盐固体物质，由于其特殊的内部结构，带有不饱和的负电荷及具强烈的阳离子产换能力，对进入人体的病毒细菌及DNA有绝对的吸附固定作用。纳米蒙脱石相对蒙脱石原石比表面积大幅提高，吸附能力显著增强；利用纳米蒙脱石的无毒性、高比表面积、高吸附性、对质粒的吸附效果等特性。但在碱性环境中，蒙脱石对DNA的吸附量有明显的下降，所以其对整个体系的酸碱度要求比较苛刻。
[0006]硅藻土是一种生物成因的硅质沉积岩，主要由古代藻类及一部分放射虫类硅质遗骸所组成。硅藻土具有多孔性，低密度，大的比表面积等特点，并且还有相对不可压缩性和化学稳定性等特殊性质。娃藻土纳米级颗粒在高离液剂存在有很大的表面能，亦具有较大负电性，在低盐溶液内结合大量水分子，DNA同样结合大量水分子。DNA与硅藻土结合后，硅藻土纳米级颗粒很好的保护DNA免受酶的降解和其它剪切。然而，硅藻土吸附DNA的能力随其本身的颗粒大小而有明显变化，过粗的颗粒DNA吸附能力极弱，不宜应用。
[0007]目前国内外对以上三种材料在环境与生物领域的应用开展了一些研宄，但对于分子生物学及药学领域研宄较少。至今尚未见到三种纳米颗粒结合各自优缺点而联用作为质粒DNA分子传递载体的报道。
【发明内容】
[0008]本发明的所解决的技术问题在于提供一种质粒DNA传递载体，其具有粒径小、吸附能力强的性质，拥有良好的质粒DNA复合能力、低细胞毒性和细胞内吞优势，是一个安全、高效的质粒DNA传递载体。
[0009]本发明目的在于提供一种可将质粒DNA吸附于表面的传递载体，其活性成分为海泡石、蒙脱石和硅藻土的混合纳米颗粒。这种传递载体可吸附质粒DNA分子，其中，所述传递载体纳米颗粒的平均粒径为25nm。
[0010]所述的质粒DNA运输载体不会改变或降低质粒DNA在后续过程中的作用。其中，所述的质粒DNA的传递载体在开发相关试剂盒的用途以及在相关药物中的应用。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:海泡石纳米材料的制备
将1g海泡石原土矿置于10mL蒸饱水中浸泡24h，待其浸泡松散后，加入0.1g焦磷酸钠，用搅拌机搅拌2h，静置沉淀。出现稳定的沉淀层后，加入0.5mol/L的HCl调节体系PH为6.0，充分搅拌20min，将上面的悬浮液倒出，用真空泵抽滤，再用蒸馏水洗涤数次，然后把滤饼放入烘箱中烘干，研碎，高压灭菌后密封保存备用。
[0012]实施例2:蒙脱石纳米材料的制备
加入6.0g蒙脱石于10mL蒸饱水中，使用电磁搅拌器搅拌至完全溶解。转速为5000r/min，离心分离2h。将沉淀转入蒸发皿，于65°C真空干燥6-10h，研磨至200目，再于65°C真空干燥2-4h，高压灭菌后密封保存备用。
[0013]实施例3:硅藻土的制备
称取1g娃藻土，用5