PKCα-siRNA质粒载体的构建、筛选方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种PKCα-siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，包括以下步骤：1）设计及合成靶向PKCα的siRNA，2）构建PKC-αsiRNA的重组质粒载体，以及PKCα-siRNA质粒载体在卵巢癌耐药方面的应用。本发明的有益效果为：成功建立了几种靶向PKC-α的siRNA重组质粒载体（pEGFP-iLenti-PKC-α），并将pEGFP-iLenti-PKC-α导入人卵巢癌耐药细胞株用于卵巢癌耐药研究，最终筛选出逆转耐药效果最好的pEGFP-iLenti-PKC-α492。这一发明为肿瘤多药耐药的逆转研究提供了一种新方法。
【专利说明】PKC a -s i RNA质粒载体的构建、筛选方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种PKCd-SiRNA质粒载体的的构建、筛选方法及其应用。
【背景技术】
[0002]化疗是继外科手术外治疗肿瘤的主要有效手段。不幸地是，多药耐药(multidrugresistance, MDR)的产生严重影响了化疗效果。因此,如何逆转肿瘤的多药耐药已成为目前肿瘤治疗研究的重点。
[0003]蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是一种磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，在细胞内信号传导中起重要作用。PKC是一类同工酶家族，它们经生长因子、激素及神经转化因子作用后发生磷酸化或活化。其中，蛋白激酶C同工酶-a (PKC-a)广泛存在于各种组织中，具有维持细胞增殖与凋亡之间平衡的作用。在许多转化细胞及肿瘤细胞中常常发现PKC-a的异常表达。PKC-a的表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力密切相关。近年来研究表明，PKC- a在肿瘤多药耐药机理上有着重要作用，PKC- a是MDR发生发展过程中的关键调节蛋白，可以作为癌症治疗的一个靶点。PKC-a的过度表达与MDR表型的高表达有着密切关系。PKC-a的活化可导致耐药蛋白P_gpl70的磷酸化及细胞内药物浓度的下降，而抑制PKC的表达能部分逆转MDR表型。进一步研究发现，将PKC- a基因转染到MCF-7乳腺癌细胞中，发现MCF-7对多柔比星和长春新碱的耐药性得到提高。在临床上，肿瘤患者中PKC-a表达阳性者的化 疗反应率明显低于阴性表达者，复发患者中PKC-a阳性表达率明显闻于未复发的患者。
[0004]1998年，Fire等首次将正义链和反义链的RNA混合物——双链RNA注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强的多的基因沉默，他们将这种现象命名为RNA 干扰(small RNAs mediating RNA interference, RNAi),从而获得 2006 年诺贝尔奖。RNAi作为真核生物中普遍存在的一种自然现象，是利用双链RNA诱发宿主细胞同源mRNA降解，从而抑制特异目的基因表达的方法。随着RNAi的深入研究，RNAi已成为肿瘤研究中的一个热点，RNAi技术在癌基因及抑癌基因的敲除、肿瘤疾病信号传导途径以及肿瘤免疫逃逸等方面的研究都被广泛开展。而近来，RNAi技术在逆转肿瘤多药耐药方面的研究正成为当前肿瘤学研究热点之一。针对不同的耐药机制，设计不同的小分子干扰RNA(smallinterference RNA, SiRNA)来逆转肿瘤耐药，已经成为研究肿瘤耐药和肿瘤基因治疗的重要组成部分。目前，虽然有关沉默PKC-α基因的siRNA质粒载体尚有一些报道，但仍存在许多问题限制其应用和发展。例如:导入肿瘤耐药细胞的成功率不高；沉默PKC-a基因的siRNA质粒载体的特异性和灵敏度不够等，这对于基因调控逆转耐药的药物研发具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种PKCa-siRNA质粒载体的构建、筛选方法及其应用，以克服现有技术存在的上述不足。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种PKC a -SiRNA质粒载体的构建及其筛选方法，包括以下步骤:
O设计及合成祀向PKCa的siRNA,进一步包括以下步骤:
1.1)根据基因库PKCa基因序列筛选出候选序列；
1.2)根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列；
1.3)确定靶向PKC- a的siRNA的目标序列；
2)构建PKC-a siRNA的重组质粒载体，进一步包括以下步骤:
2.1)退火连接单链目的基因片段；
2.2) Eco31I 酶切质粒 pEGFP-1Lenti ；
2.3) I %琼脂糖凝胶回收酶切线性空载体；
2.4)连接线性化质粒载体；
2.5)重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增；
2.6)纯化重组质粒。
[0007]进一步的，步骤1.2)根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列，进一步包括以下步骤:
1.2.1)从转录本的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；
1.2.2)利用BLAST软件将候选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列或基因表达序列标签同源的候选序列；
1.2.3)选出合适的目标序列。
[0008]进一步的，步骤1.3)中确定的目标序列为:
5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’.本发明的PKCa-siRNA 492质粒载体可以逆转肿瘤耐药表型。
[0009]本发明的PKC a -siRNA 492质粒载体可以提高肿瘤耐药细胞的药物敏感性。
[0010]本发明的有益效果为:成功建立了几种靶向PKC-a的siRNA重组质粒载体(pEGFP-1Lent1-PKC-a )，并将pEGFP-1Lent1-PKC-a导入人卵巢癌耐药细胞株用于卵巢癌耐药研究，最终筛选出逆转耐药效果最好的pEGFP-1Lent1-PKC- a 492。这一发明为肿瘤多药耐药的逆转研究提供了一种新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
[0012]图1是本发明实施例所述的重组质粒构建的流程示意图；
图2是本发明实施例所述用三种不同的转染试剂分别转染0V1228/DDP及0V1228/Taxol细胞后观察各组细胞内荧光强度图；
图3是本发明实施例所述的转染pEGFP-1Lent1-PKC-α干扰质粒后0V1228/DDP细胞中PKC- α与MDRl基因表达水平；
图4是本发明实施例所述的转染pEGFP-1Lent1-PKC-α干扰质粒后0V1228/Taxol细胞中PKC- α与MDRl基因表达水平；
图5是本发明实施例所述的转染pEGFP-1Lent1-PKC-α干扰质粒后0V1228/DDP细胞中PKC- α与MDRl蛋白表达水平；
图6是本发明实施例所述的转染pEGFP-1Lent1-PKC-α干扰质粒后0V1228/Taxol细胞中PKC-α与MDRl蛋白表达水平。
【具体实施方式】
[0013]一、靶向PKCa的siRNA的设计与合成:
1.根据基因库PKCα基因序列筛选出候选序列；
2.根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列:
①从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA” 二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
[0014]②设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
[0015]③利用BLAST软件将候选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列或基因表达序列标签(EST)同源的候选序列。
[0016]④选出合适的目标序列。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
[0017]3.最终确定四段靶向PKC-α的siRNA的目标序列 5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’.二、构建PKC a -siRNA的重组质粒载体 (I)材料 1.质粒
pEGFP-1Lenti 载体质粒购自加拿大 Applied Biological Materials 公司。
[0018]2.主要试剂
DNA回收试剂盒以及质粒小量提取试剂盒购自上海捷瑞公司。AxyPrep质粒大量试剂盒购自Axygen公司。T4DNA连接酶，限制性内切酶以及核酸分子量标准D12000购自大连Takara生物有限公司。
[0019](2)步骤
1.单链目的基 因片段的退火连接:各用30μ1退火缓冲液溶解上述合成IOD单链目的基因片段。各取2μ1+16i1退火缓冲液混匀。94°C水浴退火自然冷却至室温。各取?μ?退火产物+99μ1 Η20做100倍稀释。[0020]2.质粒 pEGFP-1Lenti 的 Eco31I 酶切:质粒 10μδ, Eco31I 5μ1 酶切，IOX 缓冲液15μ1，三蒸水补足10(^1，31:水浴611。
[0021]3.1 %琼脂糖凝胶回收酶切线性空载体 I)配制I %的琼脂糖凝胶，灌胶。
[0022]2)将DNA样品与上样缓冲液混合，加样酶切产物，60V电泳3h。
[0023]3)电泳后在长波紫外线下观察结果。
[0024]4)取一干净的离心管，称重。
[0025]5)在紫外灯下，切下含有目的基因的DNA片段的凝胶(越少越好)，提高DNA回收率，速度要快，避免有基因突变，转移至准备好的离心管中。
[0026]6)称重，向胶块中加入胶块融化液B (每IOOmg琼脂糖胶加入300μ1)，均匀混合后，50°C _60°C加热IOmin融化胶块，其间每2min颠倒混匀一次。
[0027]7)将上述胶块融化液移入GenClean柱,3000rpm室温离心30s,重复一次。
[0028]8)弃去离心液，加入500μ1洗液，8000rpm室温离心30s，重复一次。
[0029]9)弃去离心液,1000rpm室温离心I min,完全去除洗液,将GenClean柱放入干净的1.5ml离心管中。
[0030]10)加入30-50μ1洗脱缓冲液在结合柱膜中央，37°C放置2min，1000rpm室温离心lmin，离心管中液体即为回收的DNA片段溶液，取2-5μ1电泳检测浓度，即可用于实验或-20°C保存。`
[0031]4.连接:取?μ?线性化质粒载体，加入10XT4DNA连接酶缓冲液Ιμ?，T4DNA连接酶?μ?，最后用三蒸水补足?ομ?。22°C水浴连接过夜，_2°C保存。
[0032]5.重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增
I)取_80°C保存的大肠杆菌DH5 α感受态细胞悬液ΙΟΟμΙ，室温下解冻后，置于冰上。
[0033]2)加入连接产物10μ1，摇匀后置于冰上放置30min。
[0034]3)放入42°C水中热休克90s，随即冰浴3min。
[0035]4)向各管中加入700μ1不含丁胺卡那霉素的LB液体培养基，混匀。
[0036]5)混匀后，3000rpm 离心 5min。
[0037]6)弃去上清，留约ΙΟΟμΙ，用移液器吹打均匀后吸出置于已铺好的丁胺卡那霉素(终浓度为3(^g/ml)平板上。
[0038]7)消毒取菌环把菌液均匀的铺平，平放置于37°C孵箱中过夜。
[0039]8)随机挑取5个左右单个菌落溶于LB液体培养基后，各取2μ1进行PCR鉴定，含阳性克隆的菌落摇菌后，提取质粒。
[0040]6.重组质粒纯化:
重组质粒的提取纯化参照质粒小量提取试剂盒操作规程操作，所得质粒可用于转染细胞和其他分子生物学实验，具体步骤如下:
I)收菌:收集过夜培养的菌液5ml，4°C，1000Orpm离心I min，弃尽上清。
[0041]2)重组悬液:加入ΙΟΟμΙ重悬溶液，振荡充分悬浮细菌。
[0042]3)碱裂解:再加入200μ1裂解液，上下轻轻混匀，室温放置2min，直至细菌裂解呈透明蛋清状态。
[0043]4)中和:加入350μ1中和缓冲液，上下剧烈颠倒6_8次，充分混匀后室温放置5min, 4°C，12000rpm 离心 5min。
[0044]5)柱预处理:将上一步骤中的上清转移到GenClean柱中，室温8000rpm,离心15s，倒掉收集管中废液。
[0045]6)漂洗:将柱子重新放回收集管中，加入500μ1洗液，lOOOOrpm，室温离心30s，重
复一至两次。
[0046]7)再次漂洗:倒掉收集管中废液,并于lOOOOrpm，室温离心I min，彻底去除洗液。
[0047]8)洗脱:将柱放入干净的1.5ml离心管中，加入50μ1洗脱缓冲液在结合柱膜中央,37°C放置 2min, lOOOOrpm 室温离心 I min。
[0048]9)离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，取2_5μ1进行I %琼脂糖电泳检测提取的质粒DNA的大小及浓度。
[0049]7.最终构建出四种带有绿色荧光标记的载体，即pEGFP-1Lent1-PKC-α 492,746，1114及1676。重组质粒载体构建如图1所示。
[0050]三、基因递送载体的选择
1.细胞株:人卵巢癌细胞株0V1228，人卵巢癌耐顺钼细胞株0V1228/DDP，人卵巢癌耐紫杉醇细胞株0V1228/Taxol。
[0051]2.转染试剂:Lipofectamine 2000 (Invitrogen ), FuGENE 6 (Roche 公司)，EnoGeneFec (EnoGene 公司)。
[0052]3.实验分组:
Lipofectamine 2000 转染 0V1228/DDP 组；
FuGENE 6 转染 0V1228/DDP 组；
EnoGeneFec 2000 转染 0V1228/DDP 组；
Lipofectamine 2000 转染 0V1228/Taxol 组；
FuGENE 6 转染 0V1228/Taxol 组；
EnoGeneFec 2000 转染 0V1228/Taxol 组。
[0053]4.转染步骤:
1)第一日细胞消化接种于24孔板，第二日转染前细胞汇合度在95%左右；
2)弃去24孔板中旧培养基，加入900ul新鲜完全培养基；
3)IOOul无血清无抗生素培养基分别加入适量质粒和转染试剂，轻轻混匀后，静置15min ；
4)将混匀的混合物加入到细胞中，前后左右轻轻晃动以混匀后置于37°C二氧化碳培养箱培养；
5)第三日荧光显微镜观察，检测转染效率，见图2，A，B，C分别为Lipofectamine2000/FuGENE 6/EnoGeneFec 2000 转染 0V1228/DDP 组；D，E, F 分别为 Lipofectamine 2000/FuGENE 6/EnoGeneFec 2000 转染 0V1228/Taxol 组。
[0054]5.结果分析:三种转染试剂对0V1228/DDP、0V1228/Taxol卵巢癌耐药细胞均具有一定的转染效率，尤以EnoGeneFec转染试剂效果最佳,故选择EnoGeneFec转染试剂作为PKCa siRNA干扰质粒基因递送载体。
[0055]四、RT-PCR法检测PKC α干扰对卵巢癌耐药的影响
1.实验目的:检测卵巢癌细胞株以及耐药株中PKCa及耐药相关基因MDRl的基因表达水平，从而评估pEGFP-1Lent1-PKC- α的应用前景。
[0056]2.实验步骤
2.1 RNA的提取
1)细胞处理:将培养好的细胞按每IOcm2加Iml的Trizol试剂进行处理，室温下形成TRizol与细胞的混合液；
2)将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分
离；
3)12, OOOg, 4°C离心lOmin，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；
4)裂解液中加入氯仿(每使用ImlTRIzol加0.2ml氯仿)，盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s，溶液呈乳白状，无分层现象；
5)室温静置3min ; 12，OOOg，4°C离心 15min ；
6)取出离心管，样品分为三层:无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用Trizol试剂的60% ；
7)向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置IOmin；
8)12，OOOg, 4。。离心 IOmin ；
9)小心去除上清，缓慢沿管壁加入lml75%的乙醇(用DEPC处理过的水配制)，轻轻混匀。每使用Iml Trizol试剂至少加Iml 75%的乙醇；
10)12, 000g,4°C离心IOmin ;小心吸尽上清；
11)室温干燥沉淀2~5min(不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解)，加入30~50μ1的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于_70°C保存；
12)RNA浓度和纯度的测定
取RNA样品用IXTE Buffer稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按以下计算RNA的浓度=0D260X稀释倍数X0.04μδ/μ?，0D260/280在1.8~2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
[0057]2.2 RT-PCR反应的实验操作步骤:
I) RT反应(20μ1体系)；
a)使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
b)取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入
【权利要求】
1.一种PKCa-SiRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: O设计及合成祀向PKCa的siRNA,进一步包括以下步骤: 1.1)根据基因库PKCa基因序列筛选出候选序列； 1.2)根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列； 1.3)确定靶向PKC- a的siRNA的目标序列； 2)构建PKC-a siRNA的重组质粒载体，进一步包括以下步骤: 2.1)退火连接单链目的基因片段； 2.2) Eco31I 酶切质粒 pEGFP-1Lenti ； 2.3) I %琼脂糖凝胶回收酶切线性空载体； 2.4)连接线性化质粒载体； 2.5)重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增； 2.6)纯化重组质粒。
2.根据权利要求1所述的PKCa -siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于:步骤1.2)根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列，进一步包括以下步骤: 1.2.1)从转录本的AUG起始密码开始，寻找AA 二连序列，记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；` 1.2.2)利用BLAST软件将候选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列或基因表达序列标签同源的候选序列； 1.2.3)选出合适的目标序列。
3.根据权利要求2所述的PKCa -siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于:步骤1.3)中确定的目标序列为:
5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’ 。
4.权利要求1-3任一项所述的构建及其筛选方法获得的PKCa-siRNA 492质粒载体逆转肿瘤耐药表型的用途。
5.权利要求1-3任一项所述的构建及其筛选方法方法获得的PKCa-siRNA 492质粒载体提高肿瘤耐药细胞株的药物敏感性的用途。
【文档编号】C12N15/66GK103773789SQ201410011031
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】王金华, 赵丽君 申请人:江苏省肿瘤防治研究所