专利名称：一种鸡痘病毒载体穿梭质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡痘病毒载体穿梭质粒，可用于疫苗的
研究、开发和利用。
背景技术：
消灭天花是人类医学史上最伟大的成就，此过程中痘病毒起着决定性的作用。随 着分子生物学技术的发展，痘病毒在医学和生物学领域的应用不断深入。特别是1982年应 用痘苗病毒作为载体成功表达外源抗原以来，痘苗病毒、鸡痘病毒等痘病毒被广泛用于开 发基因工程活载体疫苗和生物药物。1987年，表达狂犬病病毒G基因的重组痘苗病毒首先 获准在野生动物中使用，并成功控制了欧洲和北美地区野生动物狂犬病。1990年表达新城 疫病毒F基因的重组鸡痘病毒在美国注册；1994年表达新城疫病毒HN和F基因的重组鸡 痘病毒作为首个基因工程活载体疫苗在美国获准批量生产。随着重组鸡痘病毒在兽医药领 域的成功应用，人们开始将目光投向其医用价值。1996年美国启动了用于治疗恶性黑色素 瘤的重组鸡痘病毒Aldesleukin的I期临床试验，并于2001年完成了该项目的II期临床试 验；2003年用于预防艾滋病的重组鸡痘病毒ITV完成了 I /1I期临床试验。目前，全球仍 有百余项以重组鸡痘病毒为生物制剂的研究处于医学临床试验阶段，涉及癌症、艾滋病、肝 炎、疟疾和结核等多种疾病的预防和治疗领域。 鸡痘病毒(FPV)是继痘苗病毒后又一种常用的痘病毒载体，具有与痘苗病毒相同 的优点。此外，与痘苗病毒相比，鸡痘病毒基因组更为庞大，能容纳更多外源基因而不丧失 其感染性；外源蛋白在宿主细胞内能被忠实表达，并进行必要的糖基化、羧基化等修饰；表 达产物具有良好的免疫原性，可诱导机体产生长效的细胞免疫和体液免疫；严格的胞浆内 复制，避免了病毒自身的基因及其所携带的外源基因重组入宿主细胞染色体的可能，消除 了重组鸡痘病毒应用后的遗传威胁；宿主范围较窄，只能涵盖禽类，而感染范围较宽，虽只 表现为一过性感染(又称流产性感染)，却几乎涉及所有哺乳动物细胞，即有效感染哺乳动 物细胞后表达早期基因、部分晚期基因并进行DNA的复制，但不能发育为具有感染性的成 熟病毒粒子；作为预防或治疗性生物制剂的安全性和有效性已被大量的动物和人体试验证 明。因此，鸡痘病毒不仅能用于研发禽类基因工程活载体疫苗，而且可作为非复制型活载体 用于包括人类在内的哺乳动物疾病的防治。 制备稳定、高效重组鸡痘病毒的关键涉及重组臂、启动子、终止信号、重组方式、报 告基因等多个方面，而这些与鸡痘病毒载体穿梭质粒的构建息息相关。然而，目前还没有一 种筛选简易、能够多基因全程高效表达的鸡痘病毒载体穿梭质粒。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种鸡痘病毒载体穿梭质粒，用于疫苗的研 究和开发和利用。 本发明鸡痘病毒载体穿梭质粒，其包括重组臂TKL和TKR、双向启动子PE/L、荧光
3蛋白表达盒、抗性标记基因和复制起点ori，在所述双向启动子PE/L上下游分别具有多克 隆位点MCSL和MCSR、在所述荧光蛋白表达盒两端均具有lo邓序列。将其命名为pTGP3。
在本发明中，荧光蛋白标记基因包括但不限于绿荧光蛋白基因GFP、黄荧光蛋白基 因YFP、红荧光蛋白基因RFP和蓝荧光蛋白基因CFP。在本发明的一个实例中用于筛选的荧 光蛋白为绿荧光蛋白GFP，该表达盒的启动子为PL。 所述抗性标记基因主要是指抗生素抗性基因，例如为氨苄青霉素抗性基因Amp、四 环素抗性基因Tet以及Kan等等，优选为Amp抗性标记基因。所述复制起点是为pUC ori。
为了测序需要，本发明在重组臂TKL的上游引入TKRM13-47引物结合序列，在重组 臂TKR的下游引入RV-M引物结合序列。然而，本领域技术人员应当理解，测序引物结合序 列可以根据需要进行设计。 在本发明的所有表达盒中均采用了痘病毒转录终止信号TTTTTNT，确保目的基因 有效转录。 在本发明的一个实例中，给出了一种穿梭质粒pTGP3，该质粒全长5741bp，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。 本发明进一步包括所述穿梭质粒pTGP3与外源基因重组得到的重组表达载体，用 于外源基因在宿主内表达的研究。本发明还包括含有上述质粒或重组质粒的宿主。
本发明还提供一种制备上述穿梭质粒的方法，包括如下步骤通过PCR方法分别 扩增包含鸡痘病毒282E4株TK基因及其侧翼序列的重组臂核苷酸序列，即TKL和TKR ;将 TKL和TKR先后连接至pMD18-T质粒，连接产物即pTKLR质粒；人工合成包含PE/L启动子 序列、PL启动子序列、lo邓序列、MCSL序列、MCSR序列的核苷酸片段，验证启动子活性和效 率后连接至pTKLR质粒，连接产物即pTP质粒；将GFP核苷酸序列连接至pTP质粒，连接产 物即为本发明所提供鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3。 通过将pTGP3和鸡痘病毒282E4株共转染/感染鸡胚成纤维细胞，同源重组后经 GFP和BrdU双重筛选获得重组鸡痘病毒的方式，验证鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3的有效 性。本领域技术人员很容易将本发明穿梭质粒用于制备重组鸡痘病毒活载体疫苗。
本发明提供的鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3选取鸡痘病毒严格复制非必需区TK 基因作为重组臂，最大限度的保留亲本毒株的复制能力和重组鸡痘病毒的免疫效力；选取 鸡痘病毒早、晚期强力复合启动子，不仅保证目的基因全程、高效表达，还保留在树突状细 胞内表达目的基因所必需的早期启动活性，从而确保重组鸡痘病毒在T细胞免疫应答过程 中的重要作用；在所有表达盒内添加痘病毒转录终止信号TTTTTNT，确保目的基因有效转 录；采用同源重组方式构建重组鸡痘病毒，避免直接操作庞大基因组的不便；采用TK基因 表型筛选和荧光筛选的重组鸡痘病毒双报告基因筛选方式，简化筛选程序，縮短筛选周期， 提高筛选效率。
图1显示的本发明pTGP3的质粒图谱。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的
回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等
译《分子克隆实验指南》第二版相关章节进行。 实施例1鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3的构建 1、鸡痘病毒载体穿梭质粒重组臂TKL和TKR的克隆 根据GenBank中已登录的鸡痘病毒全基因序列(NC002188)，遵循引物设计的基本
原则，通过分析、设计、筛选如下2对引物，分别用于扩增TKL和TKR的引物TKLSp :CGTTAATTAAACGGGATCATACGCAGACAGTKLASp :GCTCTAGATAGGATCCGATATCGCCGTAGCCTCCATAAACAATATKRSp :CGAGATCTCGCGCTTAACGGTGATTTTKRASp :GCACTAGTTGCGTTATTATTACATTTACTTTG 优化各步反应条件及参与反应试剂的最佳浓度，以鸡痘病毒基因组为模板，在PCR 仪上进行DNA扩增。反应总体积50 ii L(10XPCR缓冲液5 y L、20 y mol/L引物对各1 P L， 模板DNA 5ii L、 dNTP(各2. 5mmol/L)5ii L，25mmol/L MgCl2 4iiL，lU/iiL Ex-Taq DNA聚 合酶1 ii L、 ddH20 27 ii L)，筛选并确定PCR工作程序94。C 4min ;然后94°C 30s， 57°C 45s， 72°C lmin， 10个循环最后72。C延伸10min，4。C保温。扩增产物分别连接至pMD18-T载体上， 并对所构建质粒，即pMD18-TKL和pMD18-TKR进行核苷酸序列测定。
2、pTKLR质粒的构建 用BamH I和Xba I双酶切核苷酸序列测定正确的pMD18-TKL质粒，用Bgl II和 Spe I双酶切核苷酸序列测定正确的pMD18-TKR质粒，将酶切所得到的pMD18-TKL载体与 TKR片段连接，构建pTKLR质粒。
3、pTP质粒的构建 人工合成含PE/L启动子序列、PL启动子序列、lo邓序列、MCSL序列、MCSR序列的 核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示，用Sma I酶切该人工序列，用EcoR V酶切 pTKLR质粒，将酶切所得到的pTKLR质粒与人工合成片段连接，构建pTP质粒。
4、鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3的构建 用EcoR I和Pst I双酶切pTP质粒，用EcoR I和Pst I双酶切含GFP片段的质 粒(pCAG-GFP，购自addgene)，将酶切所得到的pTP质粒与GFP片段连接，构建得到鸡痘病 毒载体穿梭质粒pTGP3。该穿梭质粒载体437 1691bp区段为TKL序列；1705 1766bp 区段为MCSL序列；1767 1852bp区段为PE/L启动子序列；1853 191 lbp区段为MCSR序 列；1919 1952bp和2734 2767bp区段为loxp序列；1959 1996bp区段为pL启动子 序列；2787 3465bp区段为TKR序列。
实施例2重组鸡痘病毒
1、鸡痘病毒毒价测定 将鸡痘病毒按102-106稀释倍数接种生长于6乂30咖培养板的鸡胚成纤维细胞，补 加含1 %甲基纤维素和1 %小牛血清(FCS)的MEM作为维持液，37°C ， 5 % C02条件下培养120
5小时后，弃培养液，PBS(pH7. 2)洗2次，室温下1%甲醛固定15min，用水洗涤，0. 1%结晶紫
染色5min，用水洗涤，统计病毒空斑数计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque
forming units, PFU)。计算PFU公式如下 PFU =(病毒空斑数X稀释倍数)/染毒体积(ml) 2、细胞内同源重组 于6X30mm培养板中接种传代的鸡胚成纤维细胞1 X 105 3X 105个/ml，当细胞 生长至80%融合时，感染0. 1M0I (Multiplicity of infection)的鸡痘病毒，37°C ， 5% C02 条件下作用2小时后，与在室温下混合30分钟的转染试剂(DoTAP Lipofectin)和鸡痘病 毒载体穿梭质粒PTGP3的混合物共转染。转染后6-8小时后，更换培养液，继续培养48 72小时后通过冻融法收获病毒。
3、重组病毒的筛选 将同源重组后收获的病毒按10M0I的量接种鸡胚成纤维细胞，在接种病毒前24小 时用含40 g/ml BrdU (5-溴脱氧核糖尿苷)的MEM营养液培养，于37°C ， 5 % C02条件下培 养48 72小时，待出现细胞病变后于荧光显微镜下观察，挑取呈现荧光的病毒蚀斑并进行
病毒扩增，所得病毒即为重组鸡痘病毒。
4、重组鸡痘病毒的稳定性 将获得的重组鸡痘病毒，用鸡胚成纤维细胞连续传代10次，每代重组鸡痘病毒均 以10M0I的量接种鸡胚成纤维细胞，待出现细胞病变后置荧光显微镜下观察，判断重组鸡 痘病毒的稳定性。实验结果表明，每次传代后均可检测到阳性荧光，说明重组鸡痘病毒具有 良好稳定性。 5、外源筛选标记GFP基因的敲除 用脂质体转染法将含重组酶Cre的质粒(pCAG-Cre购自addgene)转染鸡胚成纤 维细胞，再将所获得的重组鸡痘病毒转染该细胞，于37°C，5% C02条件下培养48 72小 时，出现细胞病变后于荧光显微镜下观察，随机挑取无荧光的病毒蚀斑5个进行病毒扩增， 通过PCR鉴定表明，挑取的无荧光的病毒蚀斑均为敲除外源筛选标记GFP基因后的重组鸡 痘病毒。 上述实验表明，本发明鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3可在短期内制备出高稳定 性、高纯度的、无外源筛选标记的重组鸡痘病毒。为重组鸡痘病毒在疫苗和生物药物研发领 域成系列、成规模的应用奠定基础。
序列说明 SEQ ID No. 1是本发明实施例1中pTGP3的核苷酸序列;SEQ ID No. 2是TKL核苷 酸序列，全长1255bp，包含197bp的TK基因核苷酸序列，及TK基因上游的1058bp核苷酸序 列；SEQ ID No. 3是TKR核苷酸序列，全长679bp，包含214bp的TK基因核苷酸序列，及TK 基因下游的465bp核苷酸序列；SEQ IDNo. 4&5以及6&7分别是用于扩增扩增TKL和TKR的 引物对；SEQ ID No. 8是人工合成的含PE/L启动子序列、PL启动子序列、lo邓序列、MCSL 序列、MCSR序列的核苷酸片段。
序列表
〈110>宁一，金 〈120〉 一种鸡痘病毒载体穿梭质粒及其应用
〈130>KHP08113340. 0 〈160>8 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211>5741 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1tcgcgcgtttcggtgatgacggtg皿皿cctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgt皿gcggatgccgggagragac皿gcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggctteactetgCggC3tC3g3gcagattgtectg卿gtgc180accatetgcggtgtga皿teccgcacagatgcgte郷ag皿皿teccgcatcaggcgcc240attcgccattcaggctgcgc雄tgttggg皿gggcgatcggtgcgggcctcttcgctet300tecgccagctggcg腿gggggatgtgctgc皿ggcgatt皿gttgggte3CgCC3gggt360tttcccagtcacgacgttgt皿皿cgacggccagtgccaacgg咖gtgg420acgattcgttgatcatecgccccaatecggtetec皿gga■gacaatttetcaatttttgtagattcttcc皿tg皿gttgctete皿caggcactctett540ateggagctetcctetetgcgtegtetctttttetccctt600cateaagtttttttcgttetatetgttggtagatete皿gateagtettgtggaatttcc660tecgtegctgategag^gatetgteca皿gttetcaacaggatetecccgtecgttegt720tgtttttecctcgtetcagatggteteatectectcccgtagcteatcac7803ctega皿tetteaaccccttccagtteatctttetgtga840gattttgaattg皿c皿ggtgttetgtctettccggtgttcatgcctttt■gtecc皿皿cagtttgtetctettetcaattteccagatgatettctcat皿catgtec3960gcgtccagteacateg^teategateate1020tcte皿gggtactetcatgcaaggtecttt1080gtetecatetacteteacgtattcttcttttgattgccct1140a朋cteg皿gatecteagtcatcgctgcca3gtecgtgcaate朋gccatatt卿tggg1200cgtegatetgtttteatgattgg朋ategctegag皿3cg1260cteateacgataggccttectatettagtegtgttattgateateactggattctcgcta1320gtgcteagatteateccgggtgtttetegttcagtatcgaggtcatcatt1380agaatecttcgttttetggaaatettttctactettetgtttettcctgg1440ttgtecgctgctteteteagattegaatct1500tctgg皿gcatccatgttettacaggccctatgttttccggte朋acatcggagctegte1560gctetcteacttteaatgte1620gateategatateatgaggatgatete皿ca皿gtetetectcatgatctattgtttetg1680g郷ctecggCg3tggg3C3ttegggccccccctcgagtctegagcggcc1740gcagatctetcgatgagctcctteagtetttetettccaa1800attttteagctttttttttttegctegcgt1860
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权利要求
鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3，其包括重组臂TKL和TKR、双向启动子PE/L、荧光蛋白表达盒、抗性标记基因和复制起点ori，在所述双向启动子PE/L上下游分别具有多克隆位点MCSL和MCSR、在所述荧光蛋白表达盒两端均具有loxp序列。
2. 如权利要求1所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，荧光蛋白为GFP。
3. 如权利要求l所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，所述荧光蛋白表达盒的启动子为PL。
4. 如权利要求1所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，所述抗性标记基因为AMP。
5. 如权利要求l所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，所述复制起点为pUC ori。
6. 如权利要求1 5任一项所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，在重组臂TKL的上游 具有TKRM13-47引物结合序列，在重组臂TKR的下游具有RV-M引物结合序列。
7. 如权利要求l所述的穿梭质粒pTGP3，其特征在于，该质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. l所示。
8. 与权利要求1 7任一项所述穿梭质粒pTGP3重组得到的重组表达载体。
9. 含有权利要求1 7任一项所述穿梭质粒pTGP3或权利要求8所述重组表达载体的 宿主。
10. 权利要求1 7任一项所述的穿梭质粒pTGP3在制备重组鸡痘病毒活载体疫苗中 的应用。
全文摘要
本发明提供了一种鸡痘病毒载体穿梭质粒pTGP3，其包括重组臂TKL和TKR、双向启动子PE/L、荧光蛋白表达盒、抗性标记基因和复制起点ori，在所述双向启动子PE/L上下游分别具有多克隆位点MCSL和MCSR、在所述荧光蛋白表达盒两端均具有loxp序列。本发明质粒具有2种不同筛选标记，通过其所制备的重组鸡痘病毒能够在早、晚期全程表达1至3种不同目的基因，应用具有早、晚期表达活性的强力复合启动子，以实现目的基因全程高效表达；在荧光蛋白表达盒两侧引入loxP序列，以实现重组鸡痘病毒外源筛选标记的敲除。本发明为重组鸡痘病毒在疫苗和生物药物研发领域成系列、成规模的应用奠定基础。
文档编号C12N15/863GK101775410SQ20091007615
公开日2010年7月14日 申请日期2009年1月9日 优先权日2009年1月9日
发明者刘妍, 李昌, 李霄, 杨恩成, 田明尧, 金宁一, 金扩世, 陈漉, 高鹏, 鲁会军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所