基于慢病毒的免疫原性载体的制作方法

专利名称：基于慢病毒的免疫原性载体的制作方法
基于慢病毒的免疫原性载体相关申请的交叉引用本申请要求2008年3月观日提交的临时申请号61/040，581的优先权，其全部内 容以其全部被引入本文。发明领域本发明描述在病毒感染的预防和治疗性治疗中使用的、改进的、基于慢病毒的免 疫原性载体。本发明更具体地涉及慢病毒载体，制备、修饰、繁殖、包装慢病毒载体的方法， 和使用这样的慢病毒载体作为人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和其它疾病的疫苗的方法。
背景技术：
人类获得性免疫缺陷综合征(AIDQ和引起该疾病的人类免疫缺陷病毒(HIV)被 第一次鉴定之后几乎30年，全世界超过三千三百万人携带HIV生活，每年超过四百万人新 近感染HIV，而估计两百八十万人已因AIDS失去生命。随着HIV大流行病继续在全世界传 播，有效的HIV疫苗的需要依然迫切。HIV突变的惊人的能力、抗HIV抗体的许多目前已 知的特异性不能始终如一地中和HIV最初分离物和对HIV感染的保护性免疫相关事宜的 完全理解的缺乏已阻碍了研发具有期望有效性的HIV疫苗的努力。目前，没有疫苗显示对 抗HIV真正有效，正如对病毒的消除性免疫依然是事实上不可能的。因此，对有效疫苗基 本上未满足的需要继续存在，该疫苗不但作为AIDS的姑息治疗，而且用于减少和可能地消 除病毒的传播。尽管HIV感染的受试者的大部分发展成获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，大 约10-15%的患者感染后10年是无AIDS的，并被称作AIDS无进展者(Skppard et al.， AIDS 7 :115966(1993)，Phair，AIDS Res. Human Retroviruses 10:883885(1994))。在发 展AIDS的那些人中，大约10%的HIV感染患者在HIV感染的最初两到三年内进展到AIDS， 被称作 AIDS 快速进展者(Sh印pard et al.，AIDS 7 :115966 (1993)，Phair，AIDS Res. HumanRetroviruses 10:883885(1994))。AIDS无进展者和快速进展者中的抗HIV免疫反 应的最初表征已经为什么可能是HIV保护性免疫的相关事宜提供一些洞察力。一般而言，AIDS快速进展者具有较低水平的抗HIV蛋白的抗体(Sh印pard et al.，AIDS 7 :115966(1993)、Pantaleo et al.，N. Engl. J. Med. 332 :209216 (1995)、Cao et al.，N. Eng. J. Med. 332 :201208(1995))和低的中和自体HIV分离物的抗体或缺少该抗 体(Pantaleo et al.，N. Engl. J. Med. 332 :209216 (1995)、Cao et al.，N. Eng. Med. 332 201208(1995)) 0与无进展者相比，快速进展者中的HIV病毒粒子的血浆水平通常较 高，并且快速地复制的HIV毒株被更频繁地从快速进展者分离(Lee et al. , J. AIDS 7 381388(1994)>Mellors et al. ,Ann. Intern. Med. 122 :573579 (1995)>Jurriaans,et al., irology204 :223233 (1994))，作为免疫缺陷的结果和更具致病性的HIV变体的选择，或作 为感染快速进展者的更具致病性的HIV变体的结果(Sullivan et al. , J. Virol. 69 :4413 4422 (1995))。原发性HIV感染的血浆病毒血症的下降与⑶8+抗HIV细胞毒性T-淋巴细 胞(“CTL”)活性的存在相关(Borrow et al.，J. Virol. 68 :6103 (1994))，与该数据结合 在一起，这些数据提示杀死HIV感染细胞的抗HIV⑶8+CTL和宽广地中和HIV最初分离物的抗体可在随后暴露于HIV的未感染个体中提供治疗性抗HIV免疫反应(Haynes et al., Science 271 :324328 (1996)、Haynes，Science 260 12791286 (1993)) 历史上地，疫苗通过引出强的抗病毒中和抗体反应提供对病毒感染的防护。中和 抗体识别病毒表面上的蛋白并阻止结合到健康细胞和健康细胞的感染。然而，由于HIV亚 型的宽广的范围和允许HIV逃脱并非充分多种多样的免疫反应的快速突变率，这种方法对 HIV不是有效的。被设计为引出中和抗体的最成功的疫苗中的一些由重组的来自HIV的包 膜蛋白组成。疫苗差的保护也许是无能的结果，因此远不能刺激强大的和多种多样的细胞 和体液免疫反应。研究人员也在研发基于细胞免疫反应的HIV疫苗。细胞免疫是基于CTLs 或CD8+T淋巴细胞，这些细胞杀死被病毒感染的细胞。这种方法阻止病毒在身体中的扩增 以便疾病不发展并且病毒不太可能被传播到另一个个体。目前研发中的第一代HIV疫苗可提供一些形式的保护，但是它们将不是完全保护 的。对疾病的预防不太可能发生在第一代原型AIDS疫苗。更可能地，这些疫苗将影响疾病 的临床过程，不阻止感染，减少病毒载量和通过减慢向AIDS的进展而延长症状减轻或无症 状存活。最后，由于高的病毒载量已强烈地与增加的HIV传播速度相关，这样的疫苗可影响 人与人的传播。参见，例如Holodniy 2006。因此，疫苗可将病毒载量减少到导致降低的传播的水平。个体水平的疫苗可因此 在整个人群规模的流行病学水平上非常有益。然而，甚至部分有效的疫苗在保护一些个体 抵抗感染中将是非常有希望的。除了减少HIV传播的速度，减低感染个体中的病毒载量将 减慢向AIDS的进展并延长寿命预期。该病毒的两个生物学特点已对研发疫苗造成了最大的障碍它的惊人的遗传多样 性和它的包膜蛋白的逃避性质。参见，例如Brander，Frahm et al. 2006 ；Butler,Pandreaet al. 2007 ；和McBurney and Ross 2007。先前的集中于对HIV包膜蛋白发动免疫反应的疫 苗积极性由于HIV的这些特点已在很大程度上失败。最近失败的例子是总体上几乎没有有 效性的、含有合成的gpl20的疫苗。另一个使用三价腺病毒疫苗的疫苗试验由于在疫苗接 受者中提供预防或治疗作用的失败也被突然地暂停。相应地，对于新的、改进的和可选的用于HIV感染的预防性和治疗性治疗形式，存 在持续的和未满足的需要。对上面的文件或本文引用的任何参考资料的引用并非意欲承认上述的任何内容 是有关的现有技术。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的说明是基于本申请人可获 得的信息，并不构成任何关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。发明概述本发明提供慢病毒载体，制备、修饰、繁殖和包装这样的慢病毒载体的方法和使用 这样的载体来加强对抗受试者的一种或多种疾病的免疫反应的方法。一方面，本发明提供用于疫苗递送的改进的慢病毒载体，该载体包括5'长末端 重复序列(LTR)和3' LTR;可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列，本文也被称作 “有效负载”；和第二核酸序列，该序列被可操作地连接到所述5 ‘ LTR,包括功能REV编码序 列和含有rev反应元件(RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中 所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动。在一个实施方式中，本发明提供用于疫苗递送的改进的慢病毒载体，该载体包括5'长末端重复序列(LTR) (SEQ ID NO 8)和3' LTR(SEQ ID NO 9)；可操作地连接到所述 5' LTR的第一核酸序列，本文也被称作“有效负载”；和第二核酸序列，该序列被可操作地 连接到所述5' LTR，包括功能REV编码序列(SEQ ID NO 10)和含有rev反应元件(RRE) (SEQ ID NO :11)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸 序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动。本发明的特征在于有效负载的表达 被5' LTR驱动，同时有效负载的表达依赖Rev和含有RRE的序列的活性。换言之，5' LTR 可以是足够强大的启动子以驱动有效负载和REV的表达。在另一个实施方式中，这样的慢病毒载体可包括来自慢病毒的5' LTR;来自慢 病毒的3' LTR ；第一核酸序列，即有效负载；和第二核酸序列，该序列被可操作地连接到所 述5 ‘ LTR,包括含有RRE的序列和REV编码序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列 的上游，其中所述第一核酸序列表达feg和Pol之一或二者的全长野生型序列；其中所述第 一核酸序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动。在另一个实施方式中，用于疫苗递送的慢病毒载体包括5'长末端重复序列 (LTR)和3' LTR ；可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列；和可操作地连接到所述 5 ‘ LTR的第二核酸序列，该序列包括功能REV编码序列和含有rev反应元件(RRE)的序列， 其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序 列的转录被所述5' LTR驱动，其中慢病毒载体构建物可进一步包括一个或多个已知的慢 病毒调节元件，诸如！"at、Nef、Vif、Vpu, Vpr或其组合。在本发明的另一个实施方式中，用于疫苗递送的慢病毒载体特别地排除所有已知 的慢病毒调节元件诸如ht、Nef、Vif、Vpu和Vpr。在这样的实施方式中，编码Vpu、Vpr、 Vif、Tat、Nef中的至少一个或类似的慢病毒蛋白的核酸序列(或多个)被分裂，这样核酸 序列(或多个)不能编码功能性Vpu、Vpr、Vif、Tat、Nef或将编码Vpu、Vpr、Vif、Tat、Nef 或类似的辅助蛋白的核酸序列(或多个)从本发明的慢病毒载体系统中去除。另一方面，本发明提供体外或体内给予的药物组合物，该组合物包括本发明的慢 病毒载体；和本领域已知的药学上可接受的载体和/或遗传佐剂。另一方面，本发明提供增加载体在宿主细胞中的免疫原性的方法，包括给予包括 第一载体的药物组合物；依次地给予包括第二慢病毒载体的药物组合物，该慢病毒载体包 括5 ‘长末端重复序列(LTR)和3 ‘ LTR ；可操作地连接到所述5 ‘ LTR的第一核酸序列；和 可操作地连接到所述5 ‘ LTR的第二核酸序列，该序列被包括功能REV编码序列和含有rev 反应元件(RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸 序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动，其中所述载体的免疫原性被增加。另一方面，本发明提供诱导受试者免疫反应的方法，所述方法包括通过各种给药 途径和治疗方案，例如DNA初始免疫(prime)/慢病毒载体加强免疫(boost)、DNA初始免疫 /两个同源慢病毒载体加强免疫、DNA初始免疫/异源载体加强免疫、慢病毒初始免疫/慢 病毒载体加强免疫、慢病毒载体或DNA初始免疫/慢病毒载体加强免疫/腺病毒载体加强 免疫和反之亦然，给予包括本文公开的慢病毒载体的药物组合物，其中腺病毒载体作为第 一加强免疫被给予，慢病毒载体作为第二加强免疫被给予。因此在一个实施方式中，该方法通过经各种给药途径和治疗方案给予本文公开的 慢病毒疫苗载体，提供受试者中抗HIV或其它目标疾病的细胞介导的反应和体液免疫反应的产生，该目标疾病与构建物中编码的抗原或免疫原性序列相关。在本发明的另一个实施方式中，提供诱导受试者中的免疫反应的方法，该方法包 括本发明慢病毒疫苗载体的给予，其中各种免疫被引出。这包括全身性地或粘膜显示的细 胞或体液免疫。本发明的另一个实施方式提供初始免疫/加强免疫或异源的或同源的加强免疫 方法以增加载体的有效性和/或免疫原性，包括给予第一载体(例如核酸质粒构建物，被称 作DNA初始免疫质粒或使用本发明的慢病毒载体、基于腺病毒的载体、包括MVA和金丝雀痘 (canary pox)在内的基于痘的载体、基于VSV的载体、基于甲病毒属的载体(例如VEE、西 门利克森林病毒)、基于疱疹病毒的载体等本领域已知的载体)和随后给予本发明的慢病 毒载体，该慢病毒载体作为包括相同的有效负载的加强免疫，其中第一和第二载体之一或 二者是本发明的慢病毒载体，该慢病毒载体作为包括与DNA初始免疫质粒构建物相同的有 效负载的加强免疫，或在某些情况下，本发明的慢病毒载体作为初始免疫/加强免疫方案 的初始免疫，其后是病毒载体加强免疫(例如，利用基于腺病毒的载体、包括MVA和金丝雀 痘在内的基于痘的载体、基于VSV的载体、基于甲病毒属的载体(例如VEE、西门利克森林病 毒)、基于疱疹病毒的载体)，或反之亦然。本发明的另一个方面，用于抑制宿主中感染性的复制的人类免疫缺陷病毒(HIV) 的复制的方法被提供，包括给予药物组合物，该药物组合物包括5'长末端重复序列 (LTR)和3' LTR ；可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列；和可操作地连接到所 述5' LTR的第二核酸序列，该第二核酸序列包括功能REV编码序列和含有rev反应元件 (RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸序列和所 述第二核酸序列的转录被所述5 ‘ LTR驱动。本发明的另一个方面，提供预防上或治疗上治疗受试者的病毒、细菌、寄生虫和/ 或微生物感染的方法，包括给予需要其的受试者慢病毒载体，该慢病毒载体包括5'长末 端重复序列(LTR)和3' LTR ；可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列；和第二核酸 序列，该第二核酸序列被可操作地连接到所述5 ‘ LTR,包括功能REV编码序列和含有rev 反应元件(RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸 序列和所述第二核酸序列的转录被所述5 ‘ LTR驱动。这样的方法可另外包括使用初始免疫/慢病毒载体加强免疫方法，以及本文公开 的其它的方案。该方法能被用于，例如，在受试者中产生抵抗目标疾病的多种多样的和综合 的免疫反应，疾病包括癌症或其它的疾病状况诸如例如，且不限于，阿尔茨海默氏病、自身 免疫疾病、心血管疾病、神经性疾病、纤维变性疾病、脂类代谢疾病、细胞外基质相关的疾病 和慢性关节变性疾病或其组合。本发明的另一个方面，本发明提供包装细胞系和制备用于制备本发明的疫苗载体 的包装细胞系的方法。在一个实施方式中，提供了产生重组的慢病毒包装细胞的方法，包括 将能在所述的包装细胞中表达的核酸、用来产生转导感受态病毒样颗粒的核酸序列；和至 少一个能在所述包装细胞中表达感兴趣序列的核酸分子引入到细胞，其中所述包装细胞产 生转导感受态病毒样颗粒，该病毒样颗粒表达感兴趣的核酸序列。在每个前面提到的慢病毒载体、含有这样的慢病毒载体的药物组合物和使用这 样的慢病毒载体的方法中，慢病毒载体进一步包括下面的一个或多个，包括，例如，且不限于，编码功能上有活性的慢病毒RNA包装元件的核酸序列、编码功能性中央多聚嘌呤区 (cPPT)、中央终止序列(CTS)和3' LTR近端多聚嘌呤区(PPT)的核酸序列、和/或编码基 于非蛋白质或蛋白质的标记物或标签的核酸序列。在具体的实施方式中，本发明的慢病毒 载体包括一个或多个

图1、图2或图3描绘的慢病毒载体构建物或其任何组合。另外，本发明的慢病毒载体可包括下面的特性的一个或多个。因此，在本发明的一 个实施方式中，第一核酸序列编码一个或多个感兴趣的抗原序列。在本发明的另一个实施 方式中，一个或多个感兴趣序列的表达依赖REV-RRE活性。在本发明的另一个实施方式中， 第一核酸序列包括gag/pol编码序列。在本发明的另一个实施方式中，第一核酸序列或第 二核酸序列是未修饰的序列。在本发明的另一个实施方式中，gag编码序列包括修饰的gag 编码序列。在本发明的另一个实施方式中，修饰的gag编码序列进一步包括至少一个改变 Gag的十四烷基化受体甘氨酸残基的核苷酸置换。在本发明的另一个实施方式中，gag/pol 编码序列被修饰以增加细胞表达。在本发明的另一个实施方式中，修饰的序列包括gag序 列内的移码。在本发明的另一个实施方式中，修饰支持不是通过翻译移码介导的gag-pol 融合蛋白的高水平表达。在本发明的另一个实施方式中，cPPT是gag/pol编码序列的pol 编码序列的一部分。在本发明的一些实施方式中，功能上有活性的慢病毒RNA包装元件包 括gag包装序列。当与下面的描述和附图结合考虑时，一些示例性的实施方式的这些和其它方面将 被更好地认识和理解。然而，应被理解为，当指明优选的实施方式和其为数众多的具体细节 时，通过图解给与下面的描述，但不限于此。可在实施方式的范围内进行许多改变和修饰， 不背离其精神。附图简述图1描绘示例性的HIV疫苗候选物和其各种类似物。这个候选物是基于HIV-I的 慢病毒载体(LV)，该载体使用天然的HIV LTR作为启动子。它表达gag、pol和rev基因作 为免疫原性的有效负载。这个LV的重要特点在于将含有RRE的序列工程改造在或放置在全 长Rev编码序列的上游。这个LV的另一个重要特点是位于含有RRE的序列与Rev编码序列 之间的剪接受体(SA)位点的存在。这个LV的另一个重要特点是免疫原性的有效负载(或 多个)与含有RRE的序列的直接邻近。这个LV任选地含有非蛋白质编码遗传序列(Gtag) 以允许其在HIV治疗疫苗背景中与wt-HIV(野生型HIV)鉴别和区别开来。这个序列能被放 在SA位点的上游或下游。图1中描绘的四个其它示意图是可能的LV疫苗载体类似物的非 限制的代表性的例子。第二构建物显示RRE元件能被放在免疫原性的有效负载(或多个) 的上游或下游。第三构建物显示Gtag序列可以是可去除的。第四构建物显示为在编码Rev 蛋白的序列的下游能放置另一个遗传有效负载(或多个)，该有效负载为能编码遗传佐剂、 其它的免疫原、反义RNA、核酶等的有效负载。第五构建物是上文描述的示意性载体构建物 的组合。最后的和第六构建物含有另外的元件，该元件能被引入用于转基因表达的另外的 调节，其中SD/SA位点将是任选的。内部的启动子/Rev组合能被用在所有上面列出的构建 物中。图2描绘基于通用疫苗HIV的慢病毒载体构建物及其类似物。该通用疫苗载体是 使用天然的HIV LTR作为启动子的基于HIV-I的慢病毒载体(LV)。它包含在转导的宿主 细胞中生产、包壳和整合的最少的元件(psi、CPPT/Cts和ppt元件)。对于HIV疫苗载体，这个LV的重要特点在于全长Rev编码序列上游的含有RRE的序列的工程化和放置、在含有 RRE的序列与Rev编码序列之间的剪接受体(SA)位点的放置和免疫原性的有效负载(多个 有效负载)与RRE序列的直接邻近。这个LV含有非蛋白质编码遗传序列(Gtag)以允许其 在HIV治疗疫苗背景中与wt-HIV鉴别和区别开来。这个序列可以被放在SA位点的上游或 下游。三个其它的示意图是可能的LV疫苗载体类似物的几个非限制性例子。第二构建物 显示RRE元件能被放在遗传有效负载(或多个)的上游或下游。第三构建物显示Gtag序 列可以是可去除的。第四构建物显示在编码Rev蛋白的序列的下游能放置另一个遗传有效 负载(或多个)，该有效负载为能编码遗传佐剂、其它的免疫原、反义RNA、核酶等的有效负 载。最后的和第五构建物显示具有内部启动子调节的Rev和邻近基因表达的构型。对于图 IA中的最后的例子，SD/SA位点的存在可以是任选的。图3描绘使用SIN构型的HIV疫苗候选物和类似物。这个图呈现本申请中描述 的HIV疫苗候选物的示意图(第一从顶部开始)。这个候选物是基于HIV-I的慢病毒载体 (LV)，其天然的HIV LTR启动子活性被元件诸如隔离子的缺失、突变或插入破坏。这个基 于SIN的HIV疫苗LV表达gag、pol和rev基因作为免疫原性的有效负载。对于HIV疫苗 载体，这个LV的重要特点在于全长Rev编码序列上游的含有RRE的序列的工程化和放置、 位于含有RRE的序列与Rev编码序列之间的剪接受体(SA)位点的放置和免疫原性的有效 负载(或多个)与RRE序列的直接邻近。这个LV含有非蛋白质编码遗传序列(Gtag)以允 许其在HIV治疗疫苗背景中与wt-HIV鉴别和区别。这个序列能被放在SA位点的上游或下 游。四个其它的示意图是可能的基于SIN的LV疫苗载体类似物的非限制性例子。第二构 建物显示RRE元件能被放在免疫原性的有效负载(或多个)的上游或下游。第三构建物显 示Gtag序列可以是可去除的。从顶端数起第四构建物显示为在编码Rev蛋白的序列的下 游能放置另一个遗传有效负载(或多个)，该有效负载为能编码遗传佐剂、其它的免疫原、 反义RNA、核酶等的有效负载。最后的和第五构建物是上面描述的示意性载体构建物表示的 组合。图4A、4B、4C和4D描绘小鼠皮下(SC)HIV疫苗慢病毒候选物(例如，本文被称作 “VRX1023”)免疫的结果，该免疫诱导全身性的和粘膜性的体液和细胞免疫。在0和15天 用2 X IO7TU VRX1023皮下注射免疫小鼠两次，然后在25天处死小鼠(图A)。阴性对照组 接受2 X IO7TU慢病毒载体，该载体携带EGFP代替kg、Pol和Rev转基因。通过Elisa在 全身性(血清，图B)和粘膜水平(唾液，图C)检测抗HIV抗体。HIV-Gag肽刺激之后，通 过ICS检测表达细胞因子(在相同的通道上结合的IFNy、TNF α、IL2)的⑶8+Τ细胞(图 D)。结果被显示为每组(条)中单个的值(点)和几何平均数。图5描绘VRX1023免疫原性在DNA初始免疫、载体加强免疫背景中能被显著地改 进。用PBS、VRX1053DNA(另一个HIV疫苗慢病毒候选物)、VRX1023LV或这些的组合免疫 5组小鼠。当用DNA免疫时，小鼠接受IOOug pVRX10531M。对于LV免疫，小鼠接受IO9TU VRX1023SC。用feig和Pol肽库刺激脾细胞之后，通过ICS评价抗HIV⑶8+T细胞反应。对于 每只动物，条表示⑶3+淋巴细胞的⑶8+亚群内细胞因子(在相同的通道上结合的IFN Y、 TNFa、IL2)和活化标记物⑶69的阳性染色细胞的百分比。图6表明VRXI 023免疫原性能被载体制造优化显著地改进。用pVRX1053DNA初 始免疫(IOOug pVRXI0531M，三次)、接着用VRXI023LV加强免疫(109TUVRXI023SC，初始免疫之后2周)免疫每组5只小鼠的组。数字显示作为免疫原性改进的例证的细胞因子分泌 物的例子，LV制造优化提供该免疫原性改进。Gag诱导的细胞因子分泌的每组是独立实验 的结果。右下图显示通过使用优化的慢病毒载体，引出强大的细胞免疫，通过分泌细胞因子 (IFNy、TNFa、IL2)识别HIV-Gag抗原并产生应答的鼠⑶8+细胞达21. 11%，而使用的疫苗 剂量较低。图7描绘本发明的载体和初始免疫/加强免疫方案引出的长期细胞介导的和体液 的抗HIV免疫。用8X IO7转导单位(TU)的VRXI023在0和15天皮下(SC)注射免疫三组 小鼠，每组5只。在最后免疫之后10天、3周和2个月时分别处死每组小鼠(图A)。通过 细胞内细胞因子染色(ICS)测量T细胞对HIV-Gag的反应(点图和左侧的y轴)。用Gag 肽体外刺激脾细胞。图B显示⑶3+⑶8+T细胞亚群中细胞因子阳性细胞(在相同的通道上 结合的IFNY、TNF α、IL2)的百分比。对每只单个的动物显示细胞因子产生细胞的百分比 (点)。条代表几何平均数。用Elisa分析每组中处死时收集的血清样品以进行抗HIV IgG 的检测(红线图和右侧的y轴)。对每个时间点显示作为几何平均数连同标准偏差的数据。图8描绘初始免疫/加强免疫方案之间的比较数据，其中初始免疫是含有与慢病 毒疫苗载体或腺病毒载体相同的HIV有效负载的DNA质粒。在相等的剂量，LV诱导的抗HIV 免疫比人血清5型腺病毒(Ad5)高。根据图A描述的时间表，用三个DNA初始免疫(IOOyg DNA IM/动物)、随后用载体加强免疫(IO8TU/动物，SC)免疫每组5只小鼠的组。在两个来 源的LV和Ad5候选物之间进行头对头比较。在图B中，用编码多HIV有效负载的质粒初始 免疫小鼠，然后用相等剂量的LV VRX多HIV或用Ad5多HIV加强免疫小鼠。免疫后1个月 处死动物，并收集样品用于分析。用对HIV-Gag的ICS测量T细胞反应(条，左侧的y轴)， 该反应被显示为几何平均数连同标准偏差(⑶8+淋巴细胞亚群内的细胞因子阳性细胞(在 相同的通道上结合的IFNY、TNFa、IL2)的百分比)。将抗HIV IgG在血清中以1 100通 过Elisa进行检测(线图，右侧的y轴)。显示的结果代表在处死时的抗体反应对免疫前基 线的比率。在图C和图D中，评价了第二 Ad5候选物含有与其慢病毒负体VRX1023相同的 Gag-Pol转基因的VRC-Ad5。用相同剂量的任一个载体加强免疫之前，用相同的pVRX1053 质粒初始免疫所有的动物。图C图解用每个候选物载体加强免疫后2个月时获得的抗HIV 细胞反应，并代表每组内累积的几何平均数和标准偏差。值是CD4T细胞(多功能T细胞) 中同时分泌所有三种细胞因子的细胞的百分比。用Elisa在载体加强免疫后一个月和两个 月时评价血清中的抗HIV IgG反应(图D)。线代表每组中的几何平均数，连同标准偏差。 将免疫前基线值——在所有动物中是相似的——平均并显示为虚线。图9描绘抗HIV细胞介导的⑶8+细胞的反应的比较数据，该⑶8+细胞是从用五 个不同的疫苗方案接种的小鼠中分离出来的。异源的免疫引出CD8+T中最大的累积HIV肽 特异性细胞因子反应。用VRXI023或Ad5对每组5只小鼠的组进行同源免疫，或使用两个 载体的组合进行异源免疫。用HIV feg(上图)或Pol (下图)肽混合物刺激之后，通过计 数⑶3+⑶8+T细胞上门控的细胞因子阳性细胞定量IFN γ (左图)或TNF α (右图)的产生。 每个点代表单个的样品，条对应于每个样品组的平均数。图10描绘⑶8细胞中应对HIV-Pol刺激的T细胞多功能性，这是由ICS测量的。 门控样品中分泌IFNY、TNF α以及IL2的T细胞，这是多功能性的指征。图11描绘与腺病毒载体相比，抗载体抗体中和慢病毒载体非常差；异源的初始免疫/加强免疫方案绕过大部分抗Ad5中和作用。通过用小鼠血清以MOI 10分别温育表达 GFP的慢病毒HIV载体(例如VRX494-GFP)和Ad5_GFP评价免疫的小鼠中抗VRXI023或 VRC-Ad5的中和活性，该小鼠血清在免疫后17天获得，并80倍稀释。载体中和作用被作为 免疫后血清中GFP表达相对于免疫前血清中GFP表达的下调的函数计算。每个点代表单个 的样品，条对应于每个样品组的平均数。图12显示各种DNA初始免疫、异源加强免疫方案的免疫原性。用两种不同的DNA 初始免疫/异源加强免疫方案接种小鼠。对两种HIV抗原——Gag和Pol——的CD8+免疫 应答被测量为分泌测试的细胞因子(INFy和TNF α)中任何一种的CD8+细胞的百分比。图13显示给予基于SIV (HIV的灵长类相等物)慢病毒的疫苗载体三次、超过五个 月之后在非人类灵长类中产生的抗SIV ρ27抗体滴度水平。第三次给予之后观察到的加强 作用显示甚至多次给予之后的最小的抗载体反应。图14Α描绘用于本发明的慢病毒疫苗载体的包装辅助载体构建物，其中本发明的 慢病毒疫苗载体含有feg-pol有效负载。图14B描绘用于慢病毒疫苗载体的包装辅助载体 构建物，其中疫苗载体的有效负载与全长feg-pol不同。该辅助构建物提供包装慢病毒疫 苗载体需要的一切。图15和图16描绘用于疫苗慢病毒载体产生的包装细胞系辅助构建物，其中有效 负载核苷酸是gag/pol以及其中有效负载是除gag/pol外的核苷酸序列。序列表彳荀述SEQIDNO 是图IAHIV疫苗载体的例子。SEQIDNO :2是图IB疫苗载体的例子。SEQIDNO :3是图2A DNA初始免疫质粒构建物的例子。SEQIDNO :4是图2B的例子。SEQIDNO :5是图3A的例子。SEQIDNO :6是图;3B的例子。SEQIDNO 7是示例性的包装信号序列。SEQIDNO 8是载体pNL4-3的HIV的5 ‘ LTR的例子。SEQIDNO 9是载体pNL4-3的HIV的3 ‘ LTR的例子。SEQIDNO 10是HIV载体pNL4-3的REV基因的例子。SEQIDNO 11是HIV载体PNL4-3的RRE的例子。SEQIDNO 12是HIV载体pNL4-3的最小包装序列的例子。SEQIDNO ；13是HIV载体pNL4-3的cPPT/cTS的例子。SEQIDNO 14是HIV载体pNL4-3的PPT的例子。SEQIDNO 15是HIV载体pNL4-3的gag/pol编码序列的例子。SEQIDNO 16是移码修饰的gag/pol编码序列的例子，该序列具有移码突变。SEQIDNO17是(GGT)密码子的例子，该密码子编码HIV载体pNL4-3的Gag的十四烷基化受体甘氨酸残基。发明详述本发明涉及在病毒、寄生虫或细菌感染和癌症的预防性和治疗性治疗中使用的、 改进的、基于慢病毒的免疫原性载体、使用其的方法和其制造的方法。本发明更具体地涉及慢病毒载体，制备、修饰、繁殖、包装慢病毒载体的方法和使用这样载体和宿主细胞，更具体 地，用于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和其它疾病的方法。定义如本文所用，下面的术语的每一个具有与其在该部分相关的意思。本文使用冠词“一 (a) ”和“一 (an) ”来指一个或超过一个(即至少一个)的冠词 的语法对象。作为例子，“一个元件”指一个元件或超过一个元件。如本文所用，术语“载体”指用于将过客核酸序列(即DNA或RNA)转运进宿主细 胞的核酸分子(典型地DNA或RNA)。载体的三种常见类型包括质粒、噬菌体和病毒。优选 地，载体是病毒，其包括载体核酸的壳内形式和载体核酸已被包装在其中的病毒颗粒。用LV 转导细胞包括但并不限于三个主要步骤细胞进入、载体RNA转变为DNA和将DNA递送到细 胞核。转导感受态的(或也许有能力的)LV具有完成所有上面提到的步骤的所有元件。如本文所用，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接到启动子/调节序列的基 因产物的表达需要的核酸序列。在一些例子中，该序列可以是核心启动子序列，在其它的例 子中，该序列还可包括增强子序列和基因产物的表达需要的其它调节元件。启动子/调节 序列可以是，例如，以组织特异的方式表达基因产物的序列。如本文所用，“组织特异的”启动子指当可操作地与编码或指定基因产物的多核苷 酸连接时，引起该基因产物在活的人类细胞——基本上只有如果该细胞是对应于启动子的 组织类型的细胞——中产生的核苷酸序列。慢病毒载体本发明提供用于疫苗递送的改进的慢病毒载体。本发明的载体包括5' LTR(SEQID N0J)和3' LTR(SEQ ID NO :9)；可操作地连接到所述5‘ LTR的第一核酸序列，本文也 被称作“有效负载”；和第二核酸序列，该序列被可操作地连接到所述5' LTR，包括功能 REV (SEQ ID NO 10)和含有RRE (SEQ ID NO :11)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码 序列的上游，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动。“有 效负载”是与包装信号(SEQ ID NO :7)不同的载体的部分，该包装信号是病毒产生过程中 需要的以包装慢病毒载体的RNA形式。SEQ ID NO :12是最小包装序列的例子。本发明的载体进一步包括编码功能上有活性的慢病毒RNA包装元件(SEQ IDNO 12)的核酸序列。全长慢病毒RNA被选择地并入到病毒颗粒中作为非共价二聚体。RNA包 装进病毒颗粒依赖RNA和Gag蛋白的核壳体蛋白(NC)结构域之间的特异性相互作用。在 自然界，HIV基因组RNA并入到病毒衣壳(被称作“壳体化”)包括所谓的Psi区，该区紧接 位于(^ag起始密码子的上游并折叠成四个茎环结构，它对基因组包装是重要的；SLl到SL4。 特别地，SLl含有二聚化起始位点(DIS)、富含GC的环，该环通过相吻复合体形成而体外介 导RNA 二聚化，这大概是RNA的病毒粒子包装的先决条件。另外的顺式作用序列也已显示 促成RNA包装。这些元件中的一些位于Gag基因的前50核苷酸(nt)，包括SL4，而其它的 元件位于剪接供体位点(SDl)的上游，并实际上被绘制到覆盖基因组的前350-400nt的较 大的区，包括SLl上游约MOnt。SL1-4区是RNA包装必不可少的简单序列的例子。本领域 的技术人员知晓其它这样的序列。慢病毒载体还包括编码功能性中央多聚嘌呤区(cPPT)/cTS(SEQ ID NO :13)和 3' LTR近端多聚嘌呤区(PPT) (SEQ ID NO 9)的核酸序列。HIV和其它的慢病毒，如本领域已知的，具有在非分裂细胞中复制的独特性质。这个特性依赖使病毒DNA能够穿过宿主 细胞核膜的核输入途径的使用。在HIV反转录中，与正链合成的中心起始和终止连续的中 心链置换事件产生正链重叠；中央DNA折叠片(central DNA flap)。这个中央DNA折叠片 是由具有中心链置换事件的两个不连续的半基因组片段产生的三链DNA区，该中心链置换 事件在HIV反转录期间受中央多聚嘌呤区(cPPT)和中央终止序列(CTQ顺式控制。存在 于所有的慢病毒基因组中的多聚嘌呤区顺式活性序列(cPPT)的中心拷贝启动下游正链的 合成。链转移之后，在3' PPT处开始的上游正链区段将前进直到基因组的中心，并在不连 续的链置换事件之后终止。HIV反转录的这个最后的事件由中央终止序列(CTQ控制。本发明的一个方面是有效负载以及Rev编码序列和含有RRE的序列的转录是由相 同的启动子，即5' LTR(SEQ ID NO :8)驱动的。5' LTR具有足够的基础活性以驱动包括编 码全长抗原序列以及包装序列、和在相同的转录单位上的Rev编码序列和含有RRE序列的 核酸的有效负载的转录，条件是含有RRE的序列位于REV编码序列的上游。5' LTR可来自 HIV的各种链和分化体，如本领域已知的，并为了较强的基础启动子样功能而被优化。特别 地，来自HIV-I分化体E的5' LTR显示强的基础启动子活性。HIV的各种链和分化体是本 领域已知的，并可被用于产生本发明的慢病毒疫苗载体，该慢病毒载体包括例如——没有 限制——HIV-I组=M (表示主要的)(A、B、C、D、E、F、G、H、I和J)、0 (异常值或“外类群”)， 它是目前在喀麦隆、加蓬和法国发现的相对稀有的组，以及被指定为N(新的组)的第三组， 和其任何循环重组形式。5' LTR进一步驱动有效负载和Rev蛋白的表达。HIV Rev蛋白 指导哺乳动物细胞中未剪接的或部分剪接的病毒转录体从细胞核到胞浆的输出。Rev含有 RNA结合结构域，其结合靶转录体上存在的RRE。输出活性是由遗传上定义的效应子结构域 介导的，该结构域已被鉴别为细胞核输出信号。在本发明的另一个实施方式中，本发明的慢病毒载体可包括至少一个、但任选地 包括两个或更多个感兴趣的核苷酸序列。为了即将被表达的两个或更多个感兴趣的核苷酸 序列，载体基因组内可有两个或多个转录单元，每一个用于每个感兴趣的核苷酸序列。在那 些例子中，优选使用一个或更多个内部核糖体进入位点(IRESs)或FMDV2A样序列用于第 二(和随后的)编码序列(或多个)以多顺反子(或如本文所用，“多顺反子”)信息翻译 (Adam et al 1991J. Virol. 65，4985，其全部内容作为参考被引用)。IRES/2A(s)可以是病 毒来源(诸如EMCV IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞来源(诸如FGF2IRES、NRF IRES、Notch 21RES或EIF4IRES)。可在下文图2和图3中找到利用IRES序列的本发明的 慢病毒载体构建物的非限制性例子。第一核酸序列的方面是编码一个或多个感兴趣的抗原序列或免疫原性序列。感兴 趣的抗原序列或免疫原性序列可包括编码能引出细胞介导的反应或体液反应或二者的任 何蛋白或蛋白片段的一个序列或多个序列。该抗原能编码细菌、病毒或其它微生物的蛋白 或蛋白片段。一般而言，本发明可被用于治疗任何病毒感染或与期望的感兴趣的抗原序列 或免疫原性序列相关的其它感染。此外，在本发明的某些实施方式中，感兴趣的第一核苷酸序列或“有效负载”序列 还可包括编码酶、细胞因子、炎症趋化因子、生长因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化的 免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的转显性 负性突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、促和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白或肽、抗病毒蛋白及其衍生物(诸如具有相关的报道基团)的那些核 苷酸序列。感兴趣的核苷酸序列还可编码前体药物活化酶。当在研究背景中使用时，感兴趣 的核苷酸序列还可编码报告基因，诸如，但并不限于绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、β-半 乳糖苷酶或对抗生素诸如，例如，氨苄青霉素、新霉素、博来霉素、腐草霉素(zeocin)、氯霉 素、潮霉素、卡那霉素等的抗性基因。感兴趣的核苷酸序列还可包括充当反义RNA、小干涉 RNA (siRNA)或核酶或其任何组合的那些序列。本发明的抗原序列可进一步包括任何本领域已知的肿瘤抗原。肿瘤抗原是肿瘤细 胞中产生的在宿主中触发免疫反应的蛋白或其蛋白片段或其肽片段。肿瘤抗原在识别肿瘤 细胞中是有用的并且是癌症治疗中使用的潜在候选物。作为例子，肿瘤抗原可包括甲胎蛋 白、癌胚抗原、CA-125、上皮肿瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原。同时，本发明的另一个 方面是与阿尔茨海默氏病相关的抗原化合物、蛋白和蛋白片段。载体进一步包括所述一个或多个感兴趣序列的表达，该表达依赖REV-RRE活性。 本发明的特点是如被与有效负载相同的5' LTR表达的Rev和RRE对有效负载在细胞核中 翻译之后转运到胞浆是必需的。Rev是HIV的小的调节蛋白，它是病毒复制所必需的。Rev 的生物学作用是通过促进从感染早期到晚期的转变来控制病毒基因表达的模式，在感染早 期表达小的调节蛋白，感染晚期时较大的结构蛋白被合成并装配进病毒颗粒。Rev结合到 高度结构化的RNA区，Rev应答元件(RRE)，在那它与约8至10个结合到RRE的Rev蛋白形 成低聚物核糖核蛋白复合体。RRE的最重要的区由5个从中心接合处发出的茎环结构域组 成，用于Rev结合的核心元件由含有嘌呤丰富的凸区(SEQ ID NO=Il)的茎环结构组成。在本发明的一个实施方式中，本发明的第一核酸序列包括gag/pol编码序列(SEQ ID Ν0:Μ)。本发明可编码全长gag/pol序列或其部分或其衍生物。第一核酸序列，无论 是否编码gag/pol或要求保护的发明的任何其它抗原序列，可包括修饰的或未修饰的序列 (SEQ ID NO :15)。慢病毒载体包括作为gag/pol编码序列的pol编码序列的一部分的cPPT。 当除gag/pol外的其它有效负载在载体中时，如本文公开的其它的实施方式中所讨论的， cPPT、PPT和CTS在载体中是需要的，该载体不包括作为感兴趣的抗原序列的gag/pol编码 序列。本发明的一个实施方式，其中所述gag/pol编码序列通过慢病毒载体构建物中包 括修饰的gag编码序列被修饰以增加细胞表达。关于Pol抗原的无效表达而言，在我们目 前的疫苗中包括gag/pol前体形式的pol基因是最可能亚最佳的。由于pol编码序列的翻 译需要的移码，Pol蛋白的表达水平在自然感染过程中通常是低的。Pol表达的这种形式导 致与Gag相比Po 1蛋白达95 %的下降。为了增加Po 1表达，可去除gag和po 1之间的移码， 导致Gag和Pol的等摩尔或接近等摩尔的表达，而病毒样颗粒(VLP)的分泌将被削弱。如 此，为了优化表达(SEQ ID NO 16)，该载体包括gag序列内的移码。在本发明的一个实施方式中，慢病毒载体还支持不是由翻译移码介导的gag-pol 融合蛋白的高水平表达。本发明进一步包括至少一个改变Gag的十四烷基化受体甘氨酸残 基的核苷酸置换(SEQ ID NO :17)。十四烷基化是HIV颗粒装配过程中的关键组分。Gag p55 经历在基体的N-末端的翻译后十四烷基化，这允许Gag复合体通过肉豆蔻酸部分粘到细胞 膜。十四烷基化位点的破坏导致胞浆中Gag蛋白的积累。胞浆内蛋白的较高浓度最可能增 加这些多肽的蛋白体(proteosomal)降解进入内源性抗原途径，导致Gag肽在负载MHCI类分子上，从而导致较高的免疫反应。通过使用密码子优化的基因同样能增加抗原表达的水平。用在高度表达的人类基 因中发现的密码子偏爱产生的合成基因已显示出比自然编码序列在人类细胞中表达更有 效地多并引出更高的和更具重现性水平的免疫反应。过表达的另一个含意是需要给予的以 引出免疫反应的慢病毒载体或DNA初始免疫的量能被大大减少。在本发明的另一个实施方式中，本发明的慢病毒载体可包括——没有限制——能 被分成感染灵长类的病毒(HIV-1、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV))和感染非灵长类的病 毒(猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节 炎-脑炎病毒(CAEV)、维斯那-梅迪病毒(W)、詹布拉纳病病毒(JDV))的那些慢病毒。在本发明的另一个实施方式中，本发明的慢病毒载体还可通过去除HIV LTR的转 录元件被修饰；诸如在所谓的自身灭活(SIN)载体构型中。反转录的模态从病毒基因组的 3'端产生整合的原病毒的两个U3区，该反转录的模态通过允许所谓的自身灭活(SIN)载 体的产生推进这个任务。自身灭活依赖DNA 3'长末端重复序列(LTR)的U3区中的断裂 (利用例如，缺失、突变和元件插入)的引入，该DNA是用于产生载体RNA的。在反转录过 程中，这种缺失被转移到前病毒DNA的5' LTR0如果足够的序列被除去以废除LTR的转录 活性，转导的细胞中的全长载体RNA的产生被废除。这使RCRs将出现的危险减到最小。此 外，它减小位于载体整合位点邻近处的细胞编码序列将被异常地表达的可能性，这种异常 表达是由于3' LTR的启动子活性或通过增强子作用。最后，LTR和驱动转基因的内部启动 子之间的潜在的转录干扰被SIN设计阻止。基于SIN的慢病毒载体的一个例子在美国专利 6，924，144中被描述，该专利的全部内容作为参考以其全部被并入。本发明的基于SIN的慢 病毒载体的非限制代表性的例子可从本文描述的图1、图2和/或图3中具体显示的一个或 多个构建物或其任何组合产生。在另一个实施方式中，本发明包括药物组合物，该组合物包括本文上面描述的慢 病毒载体，该载体包括5' LTR和3' LTR;可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列； 和可操作地连接到所述5 ‘ LTR的第二核酸序列，该序列包括功能REV编码序列和含有rev 反应元件(RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸 序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动；并进一步包括“药学上可接受的载 体”或“遗传佐剂”。“药学上可接受的载体”包括，但不限于，PBS、缓冲剂、水、TRIS、其它的 等渗溶液或被优化的不损害载体的病毒成分的任何溶液。上面描述的慢病毒载体能被引入到宿主细胞用于病毒感染的预防和治疗学的治 疗、以及用于本文描述的其它理由。因此，本发明提供包括根据本发明的载体的宿主细胞。 宿主细胞的分离、和/或从其培养物中获得的这样的细胞或细胞系的维持已成为常规的事 情和普通的技术人员熟练的事情。“宿主细胞”可以是任何细胞，并优选是真核细胞。期望地，宿主细胞是抗原递呈细 胞。这样的细胞包括但并不限于皮肤成纤维细胞、肠上皮细胞、内皮细胞、上皮细胞、树突细 胞、类浆细胞树突细胞、朗格汉斯细胞、单核细胞、粘膜细胞等等。优选地，宿主细胞是真核 的、多细胞的种类(例如，与单细胞的酵母细胞相反)，并且，甚至更优选地，是哺乳动物例 如人类细胞。]细胞能作为单个实体存在或能是较大的细胞聚集体的一部分。这样的“较大的细胞聚集体”可包括，例如，细胞培养物(混合的或纯的)、组织(例如，内皮、上皮、粘膜或其它 的组织)、器官(例如，肺、肝、肌肉和其它的器官)、器官系统(例如，循环系统、呼吸系统、 胃肠系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统或其它的器官系统)、或生物(例如，鸟、哺乳动物 或类似物)。优选地，被靶向的器官/组织/细胞是循环系统(例如，包括但并不限于包括 白血细胞的血液)、鼻、气管、支气管、细支气管、肺等的粘膜系统、胃肠系统(例如，包括口、 咽、食道、胃、肠、唾液腺、胰脏、肝脏、胆囊和其它)、泌尿系统(例如，诸如肾脏、输尿管、膀 胱、尿道等等)、神经系统(例如，包括但并不限于脑和脊髓、和特殊感觉器官，诸如眼)和皮 肤系统(例如，皮肤、表皮、和皮下细胞或真皮组织)。甚至更优选地，被靶向的细胞选自抗 原递呈细胞。靶细胞不必是正常的细胞并可以是患病细胞。这样的患病细胞可以是但并不 限于肿瘤细胞、感染的细胞、遗传上异常的细胞或接近或接触异常组织的细胞诸如肿瘤血 管内皮细胞。“载体”是用于将过客核酸序列(即DNA或RNA)转移到宿主细胞的核酸分子(典 型地DNA或RNA)。载体的三种常见类型包括质粒、噬菌体和病毒。优选地，载体是病毒，其 包括载体核酸的壳体化形式和载体核酸已被包装在其中的病毒颗粒。用LV转导细胞包括 但并不限于三个主要步骤细胞进入、载体RNA转变成DNA和将DNA递送到细胞核。转导感 受态的(或也许有能力的)LV具有完成所有上面提到的步骤的所有元件。载体不是病毒的野生型毒株，因为它包括人为的突变或修饰。因此，典型地通过遗 传操作(例如，通过添加、缺失、突变、插入或本领域已知的其它技术)从野生型病毒株获得 载体以包括慢病毒，如本文进一步所描述的。如本文包括的，载体能包括DNA或RNA。例如， DNA或RNA载体能被用于获得病毒。相似地，cDNA拷贝能由病毒RNA基因组制备。可选地， cDNA(或病毒基因组DNA)部分在体外能被转录以产生RNA。这些技术对本领域技术人员来 说是熟知的，并也被描述。—方面，本发明提供在受试者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括给予药物组 合物，该组合物包括本文公开的慢病毒载体。根据本发明的方法提供感兴趣的一个或多个 基因的表达以加强或诱导免疫。被诱导的免疫可以是细胞免疫或体液免疫。更具体地，细 胞免疫反应能加强CD8+细胞和/或CD4+细胞的活性。本发明的另一个实施方式抑制传染性的复制的人类免疫缺陷病毒(HIV)在细胞 中的复制，包括在受试者中诱导免疫反应的方法，所述方法包括给予药物组合物，该组合 物包括慢病毒载体，该载体包括5' LTR和3' LTR;可操作地连接到所述5' LTR的第一 核酸序列；和可操作地连接到所述5' LTR的第二核酸序列，该序列包括功能REV编码序列 和含有rev反应元件(RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所 述第一核酸序列和所述第二核酸序列的转录被所述5' LTR驱动。该方法进一步包括用表达与第一慢病毒载体相同的第一核酸的第二慢病毒载体 依次地接触所述细胞。该方法还能与初始免疫/加强免疫方法一起使用，其中只要初始免 疫包括与随后给予的第二慢病毒载体相同的有效负载或感兴趣的基因，第一载体不需要是 慢病毒载体。本发明方法的另一个实施方式，其中慢病毒载体能作为初始免疫/多次加强免疫 方案被给予。本发明方法的另一个实施方式，其中慢病毒载体能作为初始免疫/加强免疫或初始免疫/多次加强免疫方案被给予，该方案具有交替的假型包装包膜诸如VSV-G或杆状病 毒gp-64蛋白或其组合，如下文所描述的。本发明的另一个实施方式在受试者中增强免疫反应，包括用载体接触细胞，该载 体包括5' LTR和3' LTR;可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列；和可操作地 连接到所述5 ’ LTR的第二核酸序列，该序列包括功能REV编码序列和含有rev反应元件 (RRE)的序列，其中含有RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸序列和所 述第二核酸序列的转录被所述5 ‘ LTR驱动。该方法进一步包括用表达与第一慢病毒载体相同的第一核酸的第二慢病毒载体 依次地接触所述细胞。该方法还能与初始免疫/加强免疫或初始免疫/多次加强免疫方法 一起使用，其中只要初始免疫包括与随后给予的第二慢病毒载体相同的有效负载或感兴趣 的基因，第一载体不需要是慢病毒载体。随后的给予可以在两周、四周、一个月、两个月、六 个月或一年，并作为适当的计划来随着时间维持免疫反应。本发明的另一个实施方式提供初始免疫/加强免疫方法用于增加在宿主中的载 体的免疫原性，包括给予药物组合物，该组合物包括慢病毒载体，该载体包括5' LTR和 3' LTR;可操作地连接到所述5' LTR的第一核酸序列；和可操作地连接到所述5' LTR的 第二核酸序列，该序列包括功能REV编码序列和含有rev反应元件(RRE)的序列，其中含有 RRE的序列位于REV编码序列的上游，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的转录 被所述5' LTR驱动，其中由于初始免疫/加强免疫或初始免疫/多次加强免疫方案，所述 载体的免疫原性增加。该方法进一步包括用表达与第一慢病毒载体相同的第一核酸的第二 慢病毒载体依次地给予所述宿主。“免疫原性”或“增强作用，，是载体诱导抗转基因的细胞 (即细胞介导的)免疫反应和/或体液免疫反应的能力，该免疫反应可以是全身性的反应和 /或粘膜反应。“细胞免疫”是不涉及抗体但涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞或淋巴细胞的活 化(即CD8+或CD4+活化)和细胞因子或对抗原产生应答的其它介质的释放的免疫反应。 体液免疫是抗体介导的免疫反应。在本发明的另一个方面，提供增殖和选择性地包装本发明的慢病毒载体的方法。 该方法包括本领域已知的并更详细地在2004年7月1日提交的申请号60/585，464、2005 年6月30日提交的申请号11/172，147、美国专利号6，835，568和美国
发明者F·Y·勒米亚勒, L·M·胡米尔, N·科罗霍夫, V·斯列普什金 申请人:维克西斯公司