一种重组慢病毒载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组慢病毒载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前常用的基于质粒的转录报告载体由于其染色体外游离的特性，会干扰研究的 报告网络。而基于慢病毒的报告载体可以整合到细胞染色体中，从而为研究转录激活以及 表观遗传学效应提供较为精确的模型。
[0003] Clontech公司的pLVX-DD-ZsGreenl慢病毒报告载体是一种无启动子报告载体， 其报告基因为绿色荧光蛋白DD-ZsGreenl，可有效转导正在分裂和非分裂的哺乳动物细胞， 用于检测不同启动子的转录活性。然而该载体用于筛选稳定转染细胞株的标记为嘌呤霉素 (puromycin)，它对细胞的毒性较大，容易造成细胞死亡。
[0004] Clontech公司的pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体（CatalogNo. 632187)含有组 成型活性人类巨细胞病毒立即早期启动子（PCMVIE)，在该启动子上游多克隆位点可以插 入感兴趣的蛋白编码序列，这样利用同一启动子表达一个双顺反子mRNA转录产物，从而同 时产生两种蛋白质。因此，该表达载体不能用于研究调控元件如启动子和/或增强子的转 录活性等功能。
[0005] 因此，有必要提供一种对细胞毒性小、能用于分析启动子和/或增强子的功能或 调控作用的慢病毒报告载体，尤其有必要提供一种对细胞毒性小、能用于分析启动子和/ 或增强子转录活性的慢病毒报告载体。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒 载体是在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素酶编码基 因序列。该重组慢病毒载体含有ZsGreen绿色荧光蛋白编码基因和萤火虫荧光素酶编码基 因双荧光标记，该重组慢病毒载体在分析启动子和/或增强子的功能或调控作用的应用中 对细胞的毒性较小。本发明提供的重组慢病毒载体尤其适用于分析启动子和/或增强子的 转录活性。
[0007] 本发明第二方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第一方面所述的重组 慢病毒载体。本发明第三方面提供了一种重组载体的制备方法。本发明第五方面提供了一 种重组慢病毒载体的应用。
[0008] 第一方面，本发明提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体是在 pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。
[0009] 萤火虫荧光素酶能够催化不同底物氧化发光，荧光素酶浓度在l(T16m〇l/L到 l(T8m〇l/L的范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比，其检测灵敏度高，半衰期短，所以，调控 萤火虫荧光素酶的启动子的活性改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积 累，检测荧光信号强度的变化即可反映启动子和/或增强子的活性的变化。
[0010] 本发明在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素 酶编码基因序列，构建了专门用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用的重组慢病 毒载体，该载体具有ZsGreenl和萤火虫荧光素酶双荧光标记，适用于分析启动子和/或增 强子的功能或调控作用，尤其适用于分析启动子和/或增强子的转录活性。
[0011] 本发明采用的pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体含有ZsGreen绿色荧光蛋白的突 变体，该ZsGreen绿色荧光蛋白的突变体可作为用于细胞株稳定转染的筛选标记，对细胞 毒性小。克服了pLVX-DD-ZsGreenl采用嘌呤霉素（puromycin)作为筛选标记导致的对细 胞的毒性较大，容易造成细胞死亡的缺点。
[0012] IRES序列为核糖体提供不依赖帽子结构的核糖体结合位点，翻译时，不经过mRNA 的5'端扫描，也不需要宿主细胞的某些关键因子的参与，具有IRES序列的病毒可逃脱宿主 通过这些关键因子的下调或失活来抑制病毒基因的表达。因此，pLVX-IRES-ZsGreenl含有 脑心肌炎病毒（EMCV)内部核糖体进入位点（IRES)，该IRES位于MCS与ZsGreenl之间，帮 助不依赖于帽子的ZsGreenl从IRES/ZsGreenl结合处的一个内部起始位点进行翻译，能进 一步提高ZsGreenl报告蛋白的表达效率。
[0013] 优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列是luc或Renilla荧光素酶的编码基 因序列。
[0014] 优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列是核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示的 DNA分子。
[0015] 优选地，所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处内还插入有待分析 的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列，所述待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调 控序列插入在所述萤火虫荧光素酶编码基因序列的上游。
[0016] 优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列插入在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒 载体的Clal酶切位点。
[0017] 本发明采用pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体为基础载体构建含萤火虫荧光素酶 编码基因的重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体含有pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体和 含萤火虫荧光素酶编码基因的双重优势。除上述含萤火虫荧光素酶编码基因带来的优势 外，pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体带来的优势如下：
[0018] 1、含有产生非复制性慢病毒的所有的病毒加工元件，也含有改善病毒滴度、转基 因表达和整个载体功能的元件。如：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE)启动RNA的加 工并增强病毒RNA的出核运输，使得从细胞中包装的病毒滴度增加；而且，载体含有Rev应 答元件（RRE)，通过增强非剪接病毒RNA的出核运输来进一步增加病毒滴度；另外，载体还 含有一个关键多嘌呤片段/关键终止序列元件（cPPT/CTS)，在靶细胞感染过程中，这个元 件可以产生一种关键DNA震动结构，增加病毒基因组的入核转运，使得载体整合以及转导 效率增加。
[0019] 2、载体含有pUC复制起始位点和E.coli氨苄青霉素抗性基因（Ampr)可用于细菌 筛选标记。
[0020] 第二方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含如第一方面所述的重组慢病毒载体。
[0021] 优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
[0022] 优选地，所述宿主细胞为Jurkat细胞。
[0023] 第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的重组慢病毒载体的制备方法，包 括如下步骤：
[0024] (1)、提供或制备萤火虫荧光素酶编码基因的上游引物和下游引物,及萤火虫荧光 素酶编码基因的模板，然后采用PCR扩增萤火虫荧光素酶编码基因；
[0025] (2)、取pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体，将步骤（1)扩增得到的萤火虫荧光素酶 编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处，得到所述重组慢病 毒载体。
[0026] 优选地，所述步骤（1)中，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQID NO:2 和SEQIDNO:3 所示。
[0027] 优选地，所述步骤（1)中，所述萤火虫荧光素酶编码基因的模板为含有萤火虫荧光 素酶编码基因序列的重组载体PGL4. 10。
[0028] 优选地，所述步骤（2)中，为采用In-fusion重组的方法将步骤（1)扩增得到的萤 火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处。
[0029] 优选地，所述步骤（2)中，将步骤（1)扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到 所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的Clal酶切位点。
[0030] 具体地，所述如SEQIDN0:2所示的上游引物具体为：
[0031] 5' -CTCCCAAGCTTATCGATGGCCTAACTGGCCGGTA