一种采用慢病毒技术构建的抗肿瘤迁移药物筛选细胞模型及其应用方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种表达绿色荧光蛋白的Hep-G2细胞系。
【背景技术】
[0002]肿瘤已成为目前威胁人类健康的头号杀手，抗肿瘤药物的研发和肿瘤的临床治疗成为科研的热点，因此建立有效的抗肿瘤药物筛选模型刻不容缓，肿瘤本身特有的迀移性和侵袭性是肿瘤逃避机体免疫应答的重要机制，因此抑制肿瘤迀移性和侵袭性的药物备受人们关注。
[0003]高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。
[0004]绿色焚光蛋白(GreenFluorescent Protein，简称GFP)的基因是从Aequoreavictoria水母的基因组中提取获得的，蛋白全长238AA，其65-67氨基酸残基(丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自发的形成荧光发色团，在蓝色波长范围的光线激发下，可以发出绿色荧光，吸收光谱的最大峰值为395nm，发射光谱最大峰值为509nm。如今GFP已作为报告基因被广泛应用于免疫学，神经生物学，遗传学，器官移植等各个领域。而在肿瘤相关的基础研究和药物研发领域，GFP也发挥了极大的作用。
[0005]目前在真核细胞转染和稳定细胞株构建领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。
[0006]目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding质粒)来增加其安全性，同时对启动子等序列进行修饰改造提高了病毒滴度和转染效率。最后通过改造得到了自身失活型慢病毒载体(self-1nactivat1n，SIN)有着较高的滴度，转染效率和安全性。而病毒获得后除了能用于细胞的感染外，也能用于基因治疗。
[0007]原发性肝癌(primary carcinoma of liver，以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一。在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位，在城市中仅次于肺癌;农村中仅次于胃癌Aep-G〗细胞系来源于人类肝癌组织，是研究肝癌的常用细胞系。本发明使用慢病毒系统包装绿色荧光蛋白(GFP)基因，通过慢病毒感染Hep-G2细胞，获得稳定表达GFP的Hep-G2细胞株。这一细胞株的建立大大简化了体外药物筛选的检测手段，同时可以应用于药物对动物肿瘤模型的疗效方面的研究，实现肿瘤大小和分布的实时监控和数据收集。。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种能高通量筛选抗细胞迀移药物的细胞模型。
[0009]解决本发明技术问题的技术方案为:一种筛选抗细胞迀移药物的细胞模型，是通过慢病毒将绿色荧光蛋白基因转入到Hep_G2细胞系的基因组内，获得的稳定表达绿色荧光蛋白的Η印-G2细胞株。
[0010]其中，上述细胞模型中的GFP基因能够稳定表达。
[0011]其中，上述细胞模型中的GFP序列为SEQ ID N0:1。
[0012]本发明还提供了一种制备上述筛选抗细胞迀移药物细胞模型的方法，该方法包括以下步骤:将GFP基因克隆至prrl质粒内，构建成prrl-CMV-GFP重组质粒，将该质粒和慢病毒包装质粒共转染对数期的293T细胞，收获纯化病毒，病毒感染对数期Hep-G2细胞，经有限稀释法和荧光筛选，获得本发明所述的细胞模型。
[0013]本发明还提供了一种抗细胞迀移药物的筛选方法，该方法包括以下步骤:
a.取上述的用于筛选抗细胞迀移药物的Hep-G2细胞模型接种于transwell小室的上室，筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基;
b.培养各组细胞，计数各组迀移细胞数量，根据细胞迀移数的多少确定待筛选物是否为需要的潜在药物，其中，上述的抗细胞迀移药物筛选方法的细胞迀移数为从上室迀移至下室的细胞数量。
[0014]根据本发明的第一个方面，在仔细分析不同感染技术的基础上，选择慢病毒包装系统来制备稳定表达绿色荧光蛋白的Hep_G2细胞株。本发明细胞模型中含有整合到基因组上的GFP基因的编码序列，且该序列能够稳定表达。该细胞模型通过检测荧光信号来直接进行细胞计数，简化了细胞迀移实验的步骤和流程，为实现抗细胞迀移药物高通量筛选奠定基础。
[0015]根据本发明的第二个方面，建立了制备上述筛选抗细胞迀移药物的细胞模型的方法。该方法具体可通过以下步骤实施:
将Hep_G2细胞培养至对数生长期；
将装载有GFP基因的慢病毒在polybrene的介导下感染Hep-G2细胞；
经有限稀释法和荧光显微镜筛选得到本细胞模型。
[0016]根据本发明的第三个方面，建立起了以本发明细胞模型为基础的抗细胞迀移药物筛选方法，步骤如下:
a.取上述的用于筛选的细胞模型接种于transwell小室内，细胞接种数目为2.5X104/孔-2X105/孔，优选为5X104/孔。分组为筛选组、阳性对照组和阴性对照组。其中筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基。
[0017]b.细胞孵育4_24h，优选为24h，细胞固定后，无菌棉签擦掉上室细胞，荧光显微镜下计数小室下表面4个固定视野区域的迀移细胞总数，根据迀移细胞数量确定待筛选物是否为需要的潜在药物。
[0018]其中，上述方法步骤a中加入的HGF的用量为12.5ng/ml-200ng/ml，优选为lOOng/ml ο
[0019]本发明中涉及的常规细胞培养及常规分子生物学的试验操作，都是本领域普通技术人员参考现有的相关试验指南或仪器、试剂的使用说明能够完成的。
[0020]本发明的有益效果在于:本发明细胞模型通过荧光显微镜可以直接观察迀移细胞数，能够高通量、高灵敏的准确筛选抗细胞迀移药物;本发明细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉;本发明抗细胞迀移药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性。为抗细胞迀移药物的筛选提供了新的思路，具有很好的市场前景。
【附图说明】
[0021 ] 图1:prrl-CMV_GFP重组质粒的酶切电泳图。
[0022]图2:Hep-G2-GFP细胞系稳定性分析。其中第1代和第30代分别指第1代和第30代Hep-G2-GFP细胞系，明场是指明场下细胞照片，荧光场是指荧光场下细胞照片。
[0023]图3:Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep_G2细胞系生长曲线比较。其中横坐标为细胞生长时间(培养时间)，纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值(波长450nm)o
[0024]图4:Hep-G2-GFP细胞系与野生型Hep_G2细胞系在HGF作用下细胞迀移结果分辨率；
A为明场条件下HGF作用下Hep-G2-GFP细胞系迀移照片；
B为荧光