一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA及其制备方法
【专利摘要】一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA，所述包含siRNA序列、shRNA慢病毒表达载体构建、复制缺陷型慢病毒的获得、慢病毒感染Marc-145细胞（绿猴肾细胞）以及抑制PRRSV复制效果的验证方法，该序列具有明显抑制PRRSV在敏感细胞上复制的作用。本发明对PRRSV体内外复制进行RNA干扰的探索，构建靶向PRRSV基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术，有望构建靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒的siRNA的转基因动物。为RNAi应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因功能研究以及猪繁殖与呼吸综合征的防治积累了实验数据，为动物的抗病育种提供前期准备。
【专利说明】—种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的IOIOshRNA及其制备方法
[0001]本申请是“申请日:2012年6月4日、申请号:201210180401.0、名称:一种用于抑
制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的RNAi及其制备方法”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及抑制PRRSV (猪繁殖与呼吸综合征病毒)防治【技术领域】，具体说是一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的IOlOshRNA (short hairpin RNA短发夹脱氧核糖核酸)，本发明还包括一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的IOlOshRNA的制备方法。
【背景技术】
[0003]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS),亦称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起，是一种严重危害养猪业的接触性传染病，PRRSV有欧洲型和美洲型病毒。均属于冠状病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜呈20面体或球形的RNA (核糖核酸)病毒。2006年夏秋季节暴发的“高致病性猪蓝耳病”给养猪业造成巨大经济损失，引起社会各界的广泛关注。OIE (国际兽医局)将其列为必须上报类动物疫病，是纳入世界性联防计划，予以重点控制和消灭的疫病之一。我国将其列为一类动物疫病，虽然相应灭活疫苗也获得使用，并在蓝耳病的预防控制方面取得了可喜成绩，但由于蓝耳病病毒非常容易发生变异，导致新的变异株不断出现、更迭，传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对蓝耳病的暴发和流行。RNAi (核糖核酸干扰)现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展，为蓝耳病的防制研究开辟了一个新的探索领域。
[0004]RNAi是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源mRNA(信使RNA)高效特异性降解的现象，是许多生物具有的对抗入侵的核酸，保护自身的天然机制。诱发RNAi的最关键分子是长度为19~27bp的双链RNA，被称为小干扰RNA(smallinterfering RNA, siRNA)。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,人们发现无论体内还是体外试验，siRNA均能够抑制多种病毒的增殖。利用RNAi技术来抑制(或敲低)脊椎动物细胞中任何基因的表达开始了反义遗传学的革命。Lassus等研究结果证明，RNAi作为一种实用工具诱导细胞内的基因表达沉默，使得我们以前许多无法运用传统功能基因组学技术研究的机制和模型成为可能，开创了研究基因和蛋白质功能的新天地。它最大的优点在于具有高度有效性和特异性并且具有快速防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各类疾病治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如:进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用， 并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性Marc-145细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以控制蓝耳病尤其高致病性蓝耳病的不足，构建靶向蓝耳病病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导稳定整合的RNA干扰技术，提供一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的IOlOshRNA，本发明还提供该技术的制备方法。
[0006]为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案:
[0007]一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的IOlOshRNA:通过构建IOlOshRNA (short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)慢病毒表达载体，获得完整慢病毒、以获得的慢病毒感染Marc-145细胞，筛选出具有抑制PRRSV复制的Marc-145阳性细胞克隆。
[0008]所述序列SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 包括:
[0009]1010:5，一 3，
[0010]SEQ ID N0.1:T CACCGGACAATACTTGGCACCAATACGAA[0011 ] TATTGGTGGCAAGTATTGTCC
[0012]SEQ ID N0.2:B AAAAGGACAATACTTGGCACCAATATTCG
[0013]TATTGGTGCCAGTATTGTCC
[0014]所述IOlOshRNA表达载体的构建，包括IOlOshRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。
[0015]所述复制缺陷型慢病毒的获得,包括IOlOshRNA表达质粒与Packaging Mix(包装混合物)共同转染293-FT (人胚肾细胞株)细胞，收获细胞上清，获得复制缺陷型慢病毒。
[0016]所述复制缺陷型慢病毒感染Marcl45细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染Marcl45细胞，blasticidin抗性筛选，获得抑制PRRSV复制的Marcl45阳性细胞克隆。
[0017]所述抑制PRRSV复制效果的验证方法，包括流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50及Real-time RT-PCR。
[0018]本发明还提供了 IOlOshRNA的制备及验证方法，包括以下步骤:
[0019]a.设计并合成IOlOshRNA对应的DNA序列一ds oligo。
[0020]b.利用T4DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体。
[0021]c.转化T0P10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性。
[0022]d.将上述质粒pEN/U6-1010与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架。
[0023]e.获得的表达骨架与Packaging Mix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子。
[0024]f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染Marc-145细胞，将dsoligo整合到宿主细胞的基因组上。[0025]g.blasticidin抗性筛选，获得表达IOlOshRNA的Marc-145阳性细胞克隆。
[0026]h.分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50(组织细胞半数感染量)及Real-time RT-PCR (实时定量-反转录-聚合酶链反应)验证抑制效果。
[0027]本发明采用的Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp )，对病毒的复制起关键作用，参与病毒复制过程，高度保守，并且此酶只在病毒复制时出现。另外，现对Nsp9基因序列进行分析发现，在PRRSV不同的血清型和亚型中，Nsp9的核苷酸序列高度保守。鉴于此,本方法针对Nsp9基因设计shRNA序列，经过筛选可以使Nsp9基因沉默的序列从而达到同时抑制多种血清型PRRSV复制的目的，并通过建立稳定细胞系进一步验证，这有望成为猪繁殖与呼吸综合征病毒预防和控制的一个崭新途径。
[0028]鉴于以上分析，本研究选择了在PRRSV复制过程中发挥重要作用并且具有较高保守性的Nsp9基因区域作为干扰靶区。
[0029]按照shRNA序列选择的一般原贝U,利用Invitrogen公司的BLOCK-1t? RNAiDesigner在线设计程序初步筛选一些shRNA序列，同时对干扰靶位序列进行了同源性分析。从BLAST检验结果可以看出，所选shRNA干扰靶序列在较广泛流行的PRRSV血清型中都有很闻的保守性。
[0030]当前较为常用的5种制备siRNAs的方法是体外转录法、直接化学合成法、长片段dsRNAs经RNase III类(如Dicer)降解、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达、siRNA质粒表达载体或病毒载体在细胞内表达siRNAs五种。前三种涉及到RNA操作，对实验室的要求较高。利用表达载体在细胞内表达siRNA不仅可以避开RNA操作，而且可以长效、稳定的产生RNAi效应。常用siRNA表达载体的启动子属于RNA聚合酶III(p0l III)，主要有鼠源的U6启动子、人源的U6启动子和人Hl启动子3种。各种siRNA表达载体转录出的产物是可折叠形成的shRNA，然后在细胞中被Dicer酶切割成siRNA，进而启动RNAi介导基因沉默。
[0031]使用siRNA表达载体需要合成2条编码shRNA序列的DNA单链，经退火后插入对应载体的pol III启动子下游。本发明使用的PEN/U6是含有人源U6启动子的shRNA表达载体，它是由Pol III启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制子等组成。利用已经线性化载体的粘性末端的碱基特性，将合成的一对带有4个碱基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并连接到上述PEN/U6载体。这种部分具有回文结构的DNA序列在RNA pol III启动子的作用下可以在哺乳动物细胞内转录出众多的shRNA，从而启动RNA干扰过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为表达IOlOshRNA的ds oligo与pEN/U6载体连接的重组质粒测序结果示意图； [0033]图2为pENU6/10?Ο-shRNA与plentil6/DEST表达载体重组的测序结果示意图。
[0034]图3为间接免疫荧光验证IOlOshRNA对PRRSV复制的抑制效果
[0035]图4为流式细胞术验证IOlOshRNA对PRRSV复制的抑制效果
[0036]图5为TCID50测定IOlOshRNA抗病毒效果
[0037]图6为real-time RT-PCR验证IOlOshRNA对PRRSV复制的抑制效果【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
[0039]实施例1
[0040]1、表达 IOlOshRNA 的 dsoligo 的生成
[0041]借助美国Invitrogen公司网上在线设计软件(BLOCK-1T? RNAiDesigner),确定针对pEN/U6载体要求的具体shRNA片段对应的DNA插入序列，送与宝生物工程(大连)有限公司合成并退火生成dsoligo。插入序列如下:
[0042]1010:5，一 3，
[0043]SEQ ID N0.1:T CACCGGACAATACTTGGCACCAATACGAA
[0044]TATTGGTGGCAAGTATTGTCC
[0045]SEQ ID N0.2:B AAAAGGACAATACTTGGCACCAATATTCG
[0046]2、ds oligo 与 pEN/U6 载体连接，构建 pEN/U6_shRNA
[0047]连接反应体系:
[0048]2.1双链寡核苷酸(ds oligo)的生成
[0049](I)在0.2ml的PCR扩增管中建立下列体系:
【权利要求】
1.一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010 ShRNA，其特征在于通过构建IOlOshRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，以获得的慢病毒感染Marc-145细胞，筛选表达IOlOshRNA的Marc-145细胞克隆并验证其对PRRSV的抑制效果； 所述具有抑制效果的IOlOshRNA序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，包括:
1010: 5’ — 3’
SEQ ID N0.1:T CACCGGACAATACTTGGCACCAATACGAA
TATTGGTGGCAAGTATTGTCC
SEQ ID N0.2:B AAAAGGACAATACTTGGCACCAATATTCG
TATTGGTGCCAGTATTGTCC。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA,其特征在于所述IOlOshRNA表达载体的构建，包括IOlOshRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA,其特征在于所述完整慢病毒的获得，是将IOlOshRNA表达质粒与Packaging Mix共同转染293-FT细胞，收获细胞上清，获得具有感染性的慢病毒。
4.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010shRNA,其特征在于所述用收获慢病毒感染Marc-145细胞，采用灭瘟素进行抗性筛选，获得表达IOlOshRNA的Marc-145阳性细胞克隆。
5.一种如权利要求1所述一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的1010 shRNA的制备方法，包括以下步骤: a.设计并合成IOlOshRNA对应的DNA序列一dsoligo ； b.利用T4DNA连接酶将ds oligo克隆进pEN/U6载体； c.转化T0P10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性； d.将上述pEN/U6-1010质粒与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架； e.获得的表达骨架与PackagingMix共转染293-FT细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子; f.将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染Marc-145细胞； g.blasticidin抗性筛选，获得表达IOlOshRNA的Marc-145阳性细胞克隆； h.分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50及Real-timeRT-PCR验证抑制效果。
【文档编号】C12N15/10GK103667297SQ201310752351
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2012年6月4日
【发明者】刘湘涛, 吴锦艳, 田宏, 陈妍, 尚佑军, 尹双辉, 王光祥, 靳野, 张克山, 杨顺利, 刘永杰 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所