一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂领域。该试剂盒包括包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板、生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体、酶标链霉亲和素、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液、洗涤液和稀释液。本发明试剂盒不仅利用多克隆抗体识别更多病毒抗原表位，而且利用生物素标记单克隆抗体，通过酶标酶标链霉亲和素的信号放大作用进一步提高了本试剂盒的敏感性。同时本试剂盒与猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒无交叉反应，重复性好，适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的快速诊断及研究工作。
【专利说明】一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂领域，更具体地为一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪出现呼吸道疾病为特征的传染病。是世界动物卫生组织(Office International DesEpizooties, 0IE)列入的93种法定报告的动物疫病之一。据统计，该病每年给美国的养猪业造成近5.6亿美元的经济损失(Cho and Dee, 2006)。我国于1996年从流产胎儿中分离到PRRSV，证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。随着病毒的遗传和变异，2006年，我国又爆发了以变异美洲型病毒为病原的高致病性蓝耳病(Tian K et al.，2007)，使我国养猪业蒙受了巨大的经济损失。
[0003]目前检测PPRSV的方法主要有RT-PCR法、病毒分离鉴定、免疫组化法、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法，但这些方法要么需要操作活病毒，要么操作复杂、耗时长，要么特异性和敏感性不足，不利于基层的应用和推广。而现有ELISA方法主要以人工重组蛋白作为抗原，而且在用双抗夹心法检测抗原时很少用到酶标链霉亲和素放大信号的作用，从而使得特异性和敏感性都有所不足。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒。该试剂盒在保证特异性、敏感性和重复性的前提下，能够简单快速准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的使用方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:
一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其组成包括包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板、生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体、酶标链霉亲和素、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液、洗涤液和稀释液。
[0007]所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体优选通过包含如下步骤的方法制备:利用Marc-145细胞培养PPRSV JXAl-R株，以超速离心纯化的PPRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫60日龄家兔，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后采血，分离血清；用Protein A亲和层析纯化得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体。
[0008]所述的包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板优选通过包含如下步骤的方法制备:将抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体用包被液以每孔100ng/100yL包被酶标板，4°C包被过夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封闭2小时，再以pH 7.5的PBST洗涤3次，拍干备用；所述的包被液为0.1M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
[0009]所述的生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体的浓度优选为lmg/mL。生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体优选通过包含如下步骤的方法制备:
(1)用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
(2)用0.lmol/L、pH 8.8的硼酸盐缓冲液配制浓度至少为I~3mg/mL的抗体溶液；
(3)按25~100μ g/mg的比率将生物素N-羟基琥拍酰亚胺酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h ；
(4)每250μ g生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯内加入20 μ L lmol/L的氯化铵，室温孵育IOmin ；
(5)将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。
[0010]所述的酶标链霉亲和素的浓度优选为lmg/mL。
[0011]所述的酶标链霉亲和素优选通过包含如下步骤的方法制备:称取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，于室温避光反应30分钟后加入含5mg链霉亲和素的水溶液lmL，混匀并装透析袋与0.05mol/L、pH 9.5的碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合；然后吸出透析袋中溶液，再加入5mg/mL的NaBH4溶液0.2mL,置冰箱2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L,pH 7.4的PBS中，并透析过夜；次日再离心除去不溶物，即得酶标链霉亲和素。用0.02mol/L、pH 7.4的PBS加至5mL进行测定后，冷冻干燥保存。
[0012]所述的阳性对照优选为10ng/mL纯化的PPRSV ;阴性对照为0.01 mol/L、pH 7.2的 PBS。
[0013]所述的TMB显色液优选为来自商用产品；终止液优选为2M H2SO4溶液；洗涤液优选为含有0.05% Tween-20的0.1 M PBS溶液，pH为7.2，使用时10倍稀释；稀释液优选为含有 1% BSA 的 0.01 mol/L、pH 7.2 的 PBS。
[0014]上述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的使用方法，包括如下步骤:酶标板每孔100 μ L加入待测样品，37 °C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入100 μ L1:1000倍稀释的生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，37°C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入IOOyL 1:2000倍稀释的酶标链霉亲和素，37°C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入100 μ L TMB显色液，37°C反应10分钟；每孔加入50 μ L终止液；用酶标仪在450nm处测吸光值，计算S/P值并判定结果(当S/P值≥0.18为阳性，当S/P值< 0.18时为阴性)。S为待测样品的0D450nm读值，P为阳性对照的0D450nm读值。
[0015]与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下优点和效果:
(I)本发明不仅利用多克隆抗体识别更多病毒抗原表位，而且利用生物素标记单克隆抗体，而且使用了 BAS (生物素-亲和素检测系统)_Elisas检测系统，通过酶标酶标链霉亲和素的信号放大作用大大提高了试剂盒的灵敏度和稳定性。
[0016](2)本发明通过采用即用型单一溶液TMB显色液，较常规试剂盒所用双组分显色液使用更加便利，结果更稳定。
[0017](3)本试剂盒操作简单方便，与猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒无交叉反应，重复性好，适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的快速诊断及研究工作。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020]本发明工艺流程图如图1所示。
[0021]实施例1酶标板的制备
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的制备
复苏Marc-145细胞，待细胞长成单层后，倒掉上清，接种少量JXAl-R株，加维持液(2%胎牛血清，98% DMEM高糖培养基)，37°C吸附I小时后，添加维持液至原来培养细胞的体积，37°C、6% CO2培养箱培养，待细胞病变80%以上时，将细胞瓶置于_20°C冰箱中，反复冻融3次，收集病毒液。收集的病毒液5000r/min、4°C离心30min去沉淀。上清用27000r/min、4°C离心I小时，沉淀用少量pH 7.2,0.0lM PBS重悬。以PBS制备15%、25%、35%、45%和55%质量体积比的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4°C、35900r/min离心15h。收集25%浓度处的蛋白带至离心管中，用PBS稀释重悬，36000r/min离心3小时脱糖。最后用PBS悬浮沉淀，_20°C保存备用。
[0022]2、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒多克隆抗体的制备
取适量纯化的抗原(大约3mg左右)与弗氏完全佐剂充分乳化后，采用背部多点免疫60日龄家兔；15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次；45天后收集全身血液，4°C静置过夜后3000g离心15min,收集血清。用Protein A亲和层析纯化得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体。
[0023]3、包被多克隆抗体
以每孔100ng/100 μ L包被酶标板，包被液为0.1Μ、pH 9.6碳酸盐缓冲液，4°C包被过夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封闭2小时，再以pH 7.5的PBST洗涤3次，拍干备用。
[0024]实施例2抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体的制备
1、饲养细胞的制备
将BALB/c小鼠摘除眼球放血，并分离血清供阴性对照用，拉颈脱臼处死小鼠，浸泡于75%酒精溶液5min，随即放入超净工作台内，腹部朝上固定于解剖板上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，然后用止血钳向上下两侧方向撕拉皮肤，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取不完全高糖DMEM培养液5mL，注入小鼠腹腔.右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部I?2min，也可用该注射器在腹腔内反复抽吸、注射数次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。IOOOrpm离心5min，弃上清液。先用IOmL HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2X105/mL。将细胞悬液加入96孔培养板内，每孔0.lmL，培养板置37°C含5% CO2的培养箱内培养。
[0025]2、脾细胞的制备
取合适浓度的纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原与等体积佐剂完全混匀，免疫6周龄Balb/c小鼠，注射剂量为60?100 μ g。每间隔三周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫。第一次免疫时使用弗氏完全佐剂，第二、三次使用弗氏不完全佐剂，加强免疫不使用佐剂。取最后一次加强免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球放血，分离阳性血清供检测抗体用，并将小鼠处死，浸泡于75%酒精中5min，随即放入超净台内。用无菌手术开腹，取出脾脏，放入己盛有5?IOmL不完全培养液(无血清DMEM高糖培养基，购自Hyclone公司)的平皿中轻轻洗一次，细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入200目筛网，放入另一盛有IOmL不完全培养液的平皿中。用无菌的眼科剪和眼科镊剪碎，完后晃动平皿2min，使未碾碎的组织结块沉淀。吸出上清lOOOr/min离心lOmin，去上清后即为制备好的免疫脾细胞。
[0026]3、骨髓瘤细胞悬液的制备
融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，于含10%的胎牛血清培养液(无血清DMEM高糖培养基，购自Hyclone公司)培养。选择呈对数生长的骨髓瘤细胞，于融合前于T75细胞培养瓶中扩大培养，每瓶加IOmL培养液。置37°C、含5% CO2温箱内培养。融合当天，用弯头滴管将呈对数生长的骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管内。并记下体积数，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加台盼兰染液作活细胞计数后备用。
[0027]4、细胞融合
将准备好的骨髓瘤细胞用无血清高糖DMEM培养液进行洗涤两次，同时对脾脏细胞也进行同样的洗涤，洗完后进行计数。用于细胞融合的PEG溶液、无血清高糖DMEM培养液预热至37°C。分别吸取含I X IO8个脾细胞和2?3X IO7个骨髓瘤细胞的悬浮液，加入50mL离心管中，补加不完全培养液至30mL，充分混匀。IOOOrpm离心lOmin，将上清液尽量弃去。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状，并将此离心管置于37°C水浴中。一手均匀转动离心管，另一手用ImL吸管吸取1.0mL预热的50%、pH 7.2的PEG溶液沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入。从加入到加完的时间控制在60s左右，静止I分钟之后，加入不完全培养液(终止液)开始终止融合。具体加法是第Imin加lmL，第2min加2mL (均应边加边轻轻转动离心管)，随后的3min加3mL，随后每增加I分钟终止液多加ImL直至加完20mL终止液。IOOOrpm离心5min，弃去上清。加入HAT培养液(IOmL/板)，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.lmL。培养板置37°C、含5% CO2的培养箱内培养。
[0028]5、阳性细胞的筛选和克隆
将Marc-145细胞培养于96孔细胞培养板上，快长成单层时，一块接种猪繁殖与呼吸综合征病毒JXAl-R株，另一块不接种病毒。48小时后，当出现病变时用丙酮固定。然后各加入待筛选的杂交瘤的培养上清，37°C温育I小时，用pH 7.2,0.0lM PBS洗3次，再加入羊抗小鼠IgG-FITC，37°C避光反应60min，洗涤3次后置荧光显微镜下观察。当接种病毒株孔有荧光，而对应未接种病毒没有荧光时，此细胞孔内细胞判定为阳性细胞。选取生长旺盛，形态良好的阳性细胞用有限稀释法进行克隆，最终得到单克隆杂交瘤细胞株。[0029]6、单抗腹水的制备与纯化
采用动物体内诱生腹水生产单克隆抗体的方法。取健康Balb/c雌性小鼠5只.每只腹腔注射500 μ L液体降植烷，I~2周后备用。将培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下下来，1000rpm离心lOmin，弃上清液，收集细胞。用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，并将细胞数调至IO6个/mL，每只预处理的小鼠腹腔注射500 μ L阳性克隆杂交瘤细胞；7~IOd后收集腹水，3000rpm离心lOmin，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，纯化后小管分装，_20°C冻存。取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L、pH 5.0醋酸缓冲液，用lmol/L HCl调pH至
4.8 ;按每毫升稀释腹水加11 μ L辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125 μ m)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS,用lmol/L NaOH调pH至7.2 ;在4°C下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置I小时；1000Og离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS(含137mmol/L NaCl, 2.6mol/L KC1，0.2mmol/L EDTA)中，对 50-100 倍体积的 PBS 透析，4°C过夜，其间换水3次以上；取出1000Og离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
[0030]实施例3生物素标记猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体
(1)用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素酯)溶液；
(2)用硼酸盐缓冲液(0.lmol/L, pH 8.8)配制浓度至少为I~3mg/mL的抗体溶液；
(3)按25~100μ g/mg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h ；
(4)每250μ g生物素酯内加入20 μ L lmol/L的氯化铵，室温孵育IOmin ；
(5)将抗体溶液用PBS或其他`所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。
[0031]实施例4 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的应用
一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，包括已包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板(实施例1)、生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体(实施例3)、酶标链霉亲和素、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液、洗涤液和稀释液。阳性对照为10ng/mL纯化的PPRSV ;阴性对照为0.01 mol/L、pH 7.2的PBS ；TMB显色液为来自商用产品；终止液为2M H2SO4溶液；洗涤液为含有0.05% Tween-20的0.1 MPBS溶液，pH为7.2，使用时10倍稀释；稀释液为含有1% BSA的0.01 mol/L、pH 7.2的PBS。
[0032]酶标链霉亲和素的制备:称取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的
0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室温避光反应30分钟后加入含5mg链霉亲和素(Sti^pavidin)的水溶液ImL,混匀并装透析袋与0.05mol/L、pH 9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜,使之结合；然后吸出透析袋中溶液，再加入NaBH4溶液(5mg/mL)0.2mL,置冰箱2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH 7.4的PBS中，并透析过夜；次日再离心除去不溶物，即得酶标链霉亲和素。用0.02mol/L、pH 7.4的PBS加至5mL进行测定后，冷冻干燥保存。
[0033]应用猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的具体步骤:
(O从试剂盒中取出酶标板，每孔100 μ L加入待测样品，同时阳性对照和阴性对照各加2孔，每孔lOOyL。置37°C孵育30分钟。
[0034](2)用PBST洗涤3次，每次加入350 μ L/孔，静置3min。[0035](3)每孔加入100 μ L 1:1000倍用稀释液稀释的原浓度为lmg/mL的生物素化单抗，37 °C孵育30分钟。
[0036](4)用PBST洗涤3次，每次加入200 μ L/孔，静置3min。
[0037](5)每孔加入100 μ L 1:2000倍用稀释液稀释的原浓度为lmg/mL酶标链霉亲和素，37 °C孵育30分钟。
[0038](6)用PBST洗涤5次，每次加入200 μ L/孔，静置3min。
[0039](7)每孔加入100 μ L TMB显色液，37°C反应10分钟后每孔加入50 μ L终止液。用酶标仪在450nm处测吸光值。计算S/P值并判定结果(当S/P值≥0.18为阳性，当S/P值< 0.18时为阴性)。S为待测血清样品的0D450nm读值，P为阳性对照的0D450nm读值。
[0040]ELISA临界值的判定:将50份阳性血清样本和50份阴性血清样本进行ELISA检测，计算S/P值(S为待测血清样本的0D450nm读值，P为阳性对照的0D450nm读值)，利用SPSS软件做二者S/P值的相关性分析，确定最大符合的临界值为S/P=0.18，因此判定当S/P值≥0.18为阳性，当3外值< 0.18时为阴性。
[0041 ] 实施例5具体应用效果
(1)交叉反应试验:
分别用猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性对照、猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性对照使用猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒进行交叉反应实验。结果如表1所示，表明该试剂盒与猪其他病毒性疾病间不存在交叉反应。
[0042]表1.交叉反应试验
【权利要求】
1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括:包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板、生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体、酶标链霉亲和素、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液、洗涤液和稀释液。
2.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体通过包含如下步骤的方法制备:利用Marc-145细胞培养PRRSV JXAl-R株，以超速离心纯化的PRRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫60日龄家兔，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后采血，分离血清；用Protein A亲和层析纯化得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板通过包含如下步骤的方法制备:将抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体用包被液以每孔lOOng/lOOy L包被酶标板，4°C包被过夜后，用含有2% BSA的PBST溶液37°C封闭2小时，再以pH 7.5的PBST洗涤3次，拍干备用；所述的包被液为0.1Μ、ρΗ 9.6的碳酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体的浓度为lmg/mL ;生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体通过包含如下步骤的方法制备: (1)用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液； (2)用0.lmol/L、pH 8.8的硼酸盐缓冲液配制浓度至少为I~3mg/mL的抗体溶液； (3)按25~100μ g/mg的比率将生物素N-羟基琥拍酰亚胺酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h ； (4)每250μ g生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯内加入20 μ L lmol/L的氯化铵，室温孵育IOmin ； (5)将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。
5.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的酶标链霉亲和素的浓度为lmg/mL ;酶标链霉亲和素通过包含如下步骤的方法制备:称取5mg HRP溶于0.5mL蒸懼水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室温避光反应30分钟后加入含5mg链霉亲和素的水溶液lmL，混匀并装透析袋与0.05mol/L、pH 9.5的碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合；然后吸出透析袋中溶液，再加入5mg/mL的NaBH4溶液0.2mL,置冰箱2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH 7.4的PBS中，并透析过夜；次日再离心除去不溶物，即得酶标链霉未和素。
6.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照为10ng/mL纯化的PPRSV ;阴性对照为0.01 mol/L、pH 7.2的PBS0
7.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的终止液为2M H2SO4溶液；洗涤液为含有0.05% Tween-20的0.1 M PBS溶液，pH为7.2，使用时10倍稀释；稀释液为含有1% BSA的0.01 mol/L、pH 7.2的PBS。
8.权利要求1-7任一项所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤:酶标板每孔100 μ L加入待测样品，37°C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入100 μ L 1:1000倍稀释的生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，37°C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入100 μ L 1:2000倍稀释的酶标链霉亲和素，37°C孵育30分钟，PBST洗涤；每孔加入100 μ L TMB显色液，37°C反应10分钟；每孔加入50 μ L终止液；用酶标仪在450nm处测吸光值，计算S/P值并判定结果，其中S为待测样品的0D450 nm读值，P为阳性对照的0D450nm读值，当S/P值≥0.18为阳性，当S/P值< 0.18时为阴性。
【文档编号】C07K16/10GK103808927SQ201410039309
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】李建, 曹娟, 廖园园, 秦伟, 朱薇, 刘洁, 漆世华, 谢红玲, 冯钊 申请人:武汉中博生物股份有限公司