猪繁殖与呼吸综合征病毒组合物及其用图

猪繁殖与呼吸综合征病毒组合物及其用图
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月7日提交的美国申请编号61/734, 919的优先权，所述 专利申请以引用的方式全文纳入本文。
[0003] 序列表
[0004] 此申请包括作为ASCII格式的电子*.txt文件提交的序列表，所述序列表以引用 的方式全文纳入本文。
技术领域
[0005] 本申请涉及包含猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的组合物，以及所述组合物的 用途，包括作为疫苗。
【背景技术】
[0006] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)的特征在于，母猪的严重繁殖障碍和高比例的晚期 流产和早产，以及幼猪的呼吸疾病和死亡。PRRS是由具有单链正义RNA基因组的小的包膜 病毒导致，所述病毒属于动脉病毒科（Arteriviridae)动脉病毒属（Arterivirus)。在天然 条件下，PRRS病毒在肺泡巨噬细胞中复制并且能够维持长时间的病毒血症，在一些情况下 导致持续数月的持续性感染。所述疾病于20世纪80年代晚期在美国和欧洲突然出现，随 后已经在全世界传播，给猪饲养业带来重大经济损失。所述病毒能够在被感染的农场中持 续存在，这主要是由于其存在于被持续感染的携带者母猪中。
[0007] 根据PRRS病毒所来源的大陆将其分成两种基因型。来源于北美的PRRS病毒毒株 被分类为2型基因型，而来源于欧洲的PRRS病毒毒株被指定为1型基因型。目前两种基因 型都在全球传播。所述两种基因型在基因组水平上彼此相差约40%，并且在血清学上也是 不同的。每种基因型内的分离株也表现出最高达20%的相当大的核苷酸序列异质性。PRRS 病毒似乎是通过随机突变和基因内重组事件而进化的。
[0008] 根据对西班牙毒株的序列分析，已估计PRRS病毒表现出的突变率为在每个位点 每年1-3X102次置换，这与其他快速进化的RNA病毒的突变率类似。在过去的25年中已 观察到的PRRS病毒的巨大遗传变异，以及产生与较早分离株相比更高发病率和死亡率的 PRRS病毒分离株在本领域中的出现是值得注意的。此外，正逐渐认识到每种PRRS病毒原液 (stock)通常作为遗传相关物种的混合物存在的事实。
[0009] 在兽医学中用于保护动物免患病毒疾病的常见类型的生物制品是由经修饰的活 病毒（MLV)疫苗组成。用于产生减毒活病毒疫苗的最常用的方法是在基质（通常是细胞培 养物）而非天然宿主中和/或不利条件下连续传代致病病毒，直至所述病毒从其初始的毒 力（产生疾病的能力）充分减毒但仍保持诱导保护性免疫的能力。1996年，第一种MLV疫 苗被引入北美市场，所述疫苗是基于在1991年分离的PRRS病毒毒株VR-2332。通过使所述 病毒在35-37Γ下在猿猴肾细胞（MA-104/MARC-145)中进行25次连续传代，然后在31°C下 在相同的细胞型中进行12次额外传代（共36次传代），获得所述减毒疫苗株。
[0010] 随后，由于观察到最初的PRRSMLV疫苗保护效力下降（推测是由于流行的PRRS 病毒分离株的基因组中进化的遗传改变，这导致出现毒力更强且遗传上不同的（异源的）PRRS病毒毒株），因此在1999年引入第二个版本的MLV疫苗。这次行动的原理是增大疫苗 株的遗传同源性使其超过20世纪90年代后期本领域中传播的同期病毒的遗传同源性。该 减毒疫苗株来源自在1997年从PRRS的严重病例中分离得到的JA-142PRRS病毒，并且代 表该分离株在37°C下在猴肾细胞系MARC-145中的200次连续传代。已记载了这些疫苗的 两种祖先分离株（progenitor)VR-2332和JA-142分别表现出中等水平和高水平的毒力，因 此这解释了为了产生减毒的疫苗病毒，需要在细胞培养物中在不利条件下进行中等次数的 传代（VR-2332)或在更温和的环境中进行更多次的连续传代（JA-142)。值得注意的是，将 这些减毒的PRRS病毒毒株接种到猪中导致持续4周以上的病毒血症。在此期间，所述病毒 从身体分泌物中排出，导致所述疫苗病毒传播到未接种的动物。因此，这些疫苗的使用导致 其从减毒表型倒退为毒力表型。
[0011]用野生型PRRS病毒感染猪或者用该病原体的活的减毒形式进行疫苗接种引发产 生病毒特异性但是非中和的抗体，以及产生少量中和抗体。此外，在此期间，产生有限数量 的干扰素（IFN)γ分泌细胞（SC)。病毒中和抗体和病毒特异性IFNySC的产生被认为是引 发针对PRRS病毒的保护性免疫的主要决定因素。被广泛接受的是，PRRS病毒天然会刺激不 平衡（即强体液应答，其特征在于产生丰富的非中和抗体和有限但具有潜在保护性的T细 胞介导的基于IFNy的细胞免疫）和非保护性免疫应答。之前已提出，决定产生通常观察 到的针对疫苗接种或感染的非保护性的适应性免疫应答的最相关的参数是缺少由PRRS病 毒所引发的充分的先天免疫应答。被病毒感染的细胞通常分泌I型IFN(IFNa和IFN0)， 所述I型IFN在邻近的细胞中引起分子改变以帮助这些细胞保护自身免受病毒感染。值得 注意的是，猪对PRRS病毒感染的IFNa应答几乎不存在。
[0012] 已经假设，不存在针对PRRS病毒的感染或疫苗接种的充分的先天免疫应答，可以 至少部分导致特异性病毒中和抗体的延迟产生以及猪针对这种病毒的细胞介导的免疫应 答的延迟出现。因此，PRRS病毒可通过在感染其宿主后不引发充分的IFNa产生而避开 Th-Ι型应答的发生。就这点而言，已知浆细胞样树状突细胞（pDC)在诱导早期抗病毒状态 中发挥重要作用，这是由于除了其他细胞因子（例如，对适应性免疫的发生具有重要影响 的肿瘤坏死因子（TNF)a和白细胞介素6(IL_6))以外，pDC还迅速并大量分泌IFNa。尽 管PDC仅占猪外周血单核细胞（PBMC)群的一小部分（〈1%)，它们却产生了新鲜分离的猪 PBMC样品中所分泌的IFNa中的大多数。值得注意的是，与刺激pDC分泌大量IFNa的其 他猪病毒不同，PRRS病毒引发这种细胞亚群的少量IFNa应答，甚至通过主动抑制被刺激 的pDC分泌IFNa和TNFa的能力而对其功能产生不利影响。可合理地预料到，这种阻碍 对宿主随后的适应性免疫应答的性质具有显著影响。通过在用PRRSMLV疫苗进行免疫时 提供外源性IFNa源而对PRRS病毒特异性的T细胞介导的IFNy应答的强度产生的增强 作用，提供了对该假说的支持。
[0013] 在本领域中，一直需要有效且经济的疫苗，以保护猪免受PRRS感染的影响，从而 使损失最小。

【发明内容】

[0014] 在本发明的一个实施方案中，本文提供了一种分离的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS) 病毒。所述病毒的基因组可编码选自如下的蛋白：在相对于SEQIDN0:25的第31位上包 含缬氨酸的E蛋白、在相对于SEQIDN0:25的第60位上包含丙氨酸的E蛋白，或在相对于 SEQIDN0:21的第94位上包含缬氨酸的GP3蛋白。所述病毒的基因组还可编码在相对于 SEQIDN0:25的第31位上包含缬氨酸的E蛋白、在相对于SEQIDN0:25的第60位上包含 丙氨酸的E蛋白，和在相对于SEQIDN0:21的第94位上包含缬氨酸的GP3蛋白。所述病 毒的基因组可包含SEQIDNO: 1的序列或其RNA等价序列。
[0015] 作为一个实施方案，本文还提供了一种包含所述病毒和可药用载体的疫苗。所述 疫苗还可包含免疫佐剂。
[0016] 作为一个实施方案，本文还提供了在哺乳动物中诱导特异性针对PRRS病毒的免 疫应答的方法，所述方法可包括将所述疫苗给予有此需要的哺乳动物。所述疫苗还可包含 免疫佐剂。
[0017] 在一个实施方案中，所述免疫佐剂可以是干扰素α (IFN-α)、干扰素 β (IFN-β)、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-18 ;编码干扰素α的核酸；编 码白细胞介素-12的核酸、编码白细胞介素-15的核酸；编码白细胞介素-18的核酸；编码 干扰素β的核酸；诱导或增强干扰素α的活性的物质；诱导或增强干扰素β的活性的物 质；多聚1C或多聚ICLC。可在给予所述疫苗的同时、在给予所述疫苗之后24小时内或在 给予所述疫苗之前24小时内给予所述免疫佐剂。所述给药可以是肌肉内、真皮内、粘膜、口 月艮、舌下、眼内、鼻内、静脉内、腹膜内、局部或经皮肤给药。所述给药可以是肌肉内给药。
[0018] 本文还提供了分离的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)病毒，其被保藏在美国典型 菌种保藏中心（theAmericanTypecultureCollection)，被指定为ATCC专利保藏号 PTA-120658。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的分离的毒 株，其中所述毒株是G16X、111698或794A61。在一个实施方案中，所述毒株是G16X。在一 个实施方案中，所述毒株具有SEQIDN0:1中所示的基因组RNA序列（毒株G16X)。在一 个实施方案中，本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的分离的毒株，其中所述 毒株具有SEQIDN0:1(毒株G16X)或SEQIDN0:3(毒株111698)中所示的基因组RNA序 列。在一个实施方案中，本发明提供了PRRSV的分离的毒株，所述毒株具有由SEQIDN0:12 和SEQIDNO: 14中所示的序列表征的蛋白E序列；由SEQIDNO: 16和SEQIDNO: 17表征 的GP3序列；由SEQIDN0:7表征的Nsp2序列；和/或由SEQIDNO: 19表征的GP4序列。
[0020] 在一个实施方案6中，本发明提供了PRRSV的分离的毒株，其中所述毒株具有与 SEQIDN0:1(G16X)具有至少95%同一性的核酸序列，并且所述毒株相对于PRRS病毒毒株 89-46448-40的蛋白序列具有一个或多个所编码的氨基酸置换，所述氨基酸置换选自：蛋 白Nsp2V/M67V;蛋白Nsp2P/S490P、Nsp2P495L;Nsp2Y338H;蛋白EI31V;蛋白ET60A; 蛋白GP3I94V;和蛋白GP3P/S96S。在一个实施方案中，所述毒株具有一个或多个如以 下所示的所编码的氨基酸：蛋白Nsp2 67V;蛋白Nsp2 490P;蛋白Nsp2Y338H;蛋白Nsp2 P495L;蛋白E31V;蛋白E60A;蛋白GP3 94V;蛋白GP3L213F;蛋白GP3 96S和蛋白GP4 A32S。在其他实施方案中，所述毒株具有如本文别处所描述的同一"性水平百分数。在一个 实施方案中，有利的是，当PRRSV的疫苗株被给予猪时，其具有由例如巨噬细胞产生的高的 干扰素α应答的表型。在一个实施方案7中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含 至少一种分离的PRRSV毒株以及还包含可用于兽医用途的药物载体，所述分离的PRRSV毒 株选自G16X、111698和实施方案6的毒株。
[0021] 在一个实施方案中，本发明提供了在动物中诱导特异性针对猪繁殖与呼吸综合征 病毒（PRRSV)的免疫应答的方法，所述方法包括给予动物本文所描述的免疫原性组合物的 步骤。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物还包括免疫佐剂。
[0022] 在一个实施方案中，免疫原性组合物还包括免疫佐剂。在一个实施方案中，所述 免疫佐剂包括以下物质中的至少一种：干扰素α、干扰素β、白细胞介素-12、白细胞介 素-15、白细胞介素-18、在猪细胞中表达的编码干扰素α的核酸、在猪细胞中表达的编码 白细胞介素-12的核酸、在猪细胞中表达的编码白细胞介素-15的核酸、在猪细胞中表达的 编码白细胞介素-18的核酸、在猪细胞中表达的编码干扰素β的核酸、诱导或增强干扰素 β或干扰素α或二者的活性的物质，以及多聚1C或多聚ICLC。在一个实施方案中，在给 予所述免疫原性组合物的同时、在给予所述免疫原性组合物之后24小时内或在给予所述 免疫原性组合物之前24小时内给予所述免疫佐剂。
[0023] 在一个实施方案中，免疫原性组合物的给药是肌肉内、真皮内、粘膜、口服、舌下、 眼内、鼻内、静脉内、腹膜内、局部或经皮肤给药。在一个实施方案中，给药是肌肉内给药。
【附图说明】
[0024] 图1说明在用PRRS病毒分离株89-46448-40、NADC-20或模拟接种物（mock inoculum)感染后第7天和第14天，猪的体重改变（％)。根据激发时的体重来确定体重增 加百分数。计算各组的平均值（土SEM)。
[0025] 图2表示在用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20或模拟接种物感染猪之后 的血清病毒血症。在ZMAC细胞（ATCCNo.PTA-8764,野猪（Susscrofa)(猪（pig/swine)) 肺组织细胞）中测定猪血清样品中传染性病毒的数量（TCID5(]/ml)。
[0026] 图3说明用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20或模拟接种物感染14天的 猪的肺部总病理学得分。根据本领域已知的评分系统来确定总肺病理学得分。
[0027]图 4A-4D提供了PRRS病毒分离株 89-46448-40 和衍生毒株 794A61、111698 和G16X 之间非结构蛋白2(Nsp2,图4A)、蛋白E(图4B)以及糖蛋白GP3(图4C)和GP4(图4D)的 一级结构中预测的氨基酸差异。粗体字母示出了PRRSV89-46448-40、794A61、111698和 G16X的完整蛋白E和GP3以及Nsp2和GP4的连续部分（以〈和〉指示）的预测的氨基酸 序列中有区别的氨基酸位点。加框的字母对示出了PRRS病毒89-46448-40的一些蛋白中 的多态位点。
[0028] 图5示出了猪肺泡巨噬细胞针对不同类型的PRRS病毒感染的干扰素α应答。以 标示的感染复数（Μ0Ι)用PRRS病毒感染ZMAC细胞。通过特异性针对猪干扰素α的ELISA 测定在所述细胞暴露于所标示的病毒后8h时收集的培养物上清液中干扰素α的量。
[0029] 图6示出了不同的PRRS病毒毒株对于肺泡巨噬细胞对多聚（I:C)的干扰素α应 答的影响。模拟感染或用标示的病毒（Μ0Ι= 5)感染ZMAC细胞。在孵育2h之后，将细胞 培养物暴露于25mg/ml多聚（I:C)。8h后收集细胞培养基，并通过特异性针对猪干扰素α 的ELISA检测干扰素α的存在。
[0030] 图7提供了在用有毒力的PRRS病毒激发后第7天时未接种PRRS病毒（PRRS virusnaive)和接种PRRS病毒的猪的体重改变（％)。根据激发时体重来确定体重增加 百分数。计算每组的平均值（土SEM)。
[0031] 图8说明用有毒力的PRRS病毒激发之后在未接种PRRS病毒和接种PRRS病毒的 猪中的病毒血症的程度和频率。通过实时定量PCR来测定在用有毒力的PRRS病毒激发之 后第7天从猪采集的血清样品中PRRS病毒基因组的拷贝数。
[0032] 图9不出了用有毒力的PRRS病毒激发之后在未接种PRRS病毒和接种PRRS病毒 的猪中的BAL液中的病毒载量。在ZMAC细胞中滴定在用有毒力的PRRS病毒激发后第14 天采集的猪BAL液样品中的传染性病毒的量（TCIDM/ml)。
[0033]图 10A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:26)、89-46448-40、794A61 和 111698(后三者为SEQIDN0:25)的蛋白E氨基酸序列的比对。图10B示出了来自G16X的 蛋白E的氨基酸序列（SEQIDN0:26)，图10C示出了来自毒株89-46448-40的蛋白E的氨 基酸序列（SEQIDN0:25)。
[0034]图 11A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:23)、89-46448-40(SEQIDN0:23)、 794A61(SEQIDNO:23)和 111698(SEQIDNO:24)的GP4 氨基酸序列的比对。图 1IB示出 了来自毒株89-46448-40的GP4的氨基酸序列（SEQIDNO: 23)。图11C示出了与PRRSV分 离株89-46448-40相关的GP4的氨基酸序列（SEQIDN0. 24)。
[0035]图 12A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:22)、89-46448-40(SEQIDN0:21)、 794A61(SEQIDN0:22)和 111698(SEQIDN0:48)的GP3 氨基酸序列的比对。图 12B表示 来自毒株89-46448-40的GP3的氨基酸序列（SEQIDN0:21)。图12C表示与PRRSV分离株 G16X相关的GP3的氨基酸序列（SEQIDN0. 22)。
[0036] 图13示出了用IngelvacPRRSMLV或G16X接种后猪的血清干扰素α的水平。如 在"材料和方法"中所述用IngelvacPRRSMLV或G16X接种两组猪（η= 6)。在接种后所 标示的时间点采集血清样品并通过ELISA测定血清干扰素α的水平。数据代表在每个处 理组中每个时间点检测的6个样品的平均值土SE。模拟接种动物在每个测试的时间点具有 <2pg/ml血清（数据未示出）。
[0037] 图14示出了暴露于有毒力的PRRS病毒之后猪的体重（BW)改变。在用野生型 PRRSV分离株LTX1激发之前不久以及激发后第7、10和14天对模拟接种、接种Ingelvac PRRSMLV或接种G16X病毒的猪（每组η= 6)进行称重。还在所述4个时间点对未被激 发且未接种的动物（严格对照，η= 6)进行称重。在个体基础上测定激发后接下来的第7、 10和14天期间的BW改变，并计算相对于激发时BW的体重改变百分数（％)。结果代表每 组的平均体重改变百分数)+/_SDEV。除了G16X组，所有组都是由每组6只动物组成。 G16X组有6只动物，直到第10天该组减少到5只动物。该组中的一只动物被排除，因为它 患了肠扭转，需要在病毒激发后第10天对该动物施行安乐死。
[0038] 图15不出了暴露于有毒力的PRRS病毒后猪的病毒血症的程度和频率。在用野生 型PRRS病毒LTX1激发之前不久和激发后的标示天数从模拟接种、接种IngelvacPRRSMLV 或接种G16X病毒的动物采集血清样品。还在这些时间点采集未激发且未接种的动物（严 格对照）（η= 6)的样品。通过在ZMAC细胞中进行传染性病毒滴定来测定血清中的病毒载 量。提供各个猪的结果，然后计算每组成员的平均值（水平红色柱）。在激发后第10天将 G16X组的一只猪从试验中排除（参见图14的图注）。
[0039] 图16不出了暴露于有毒力的PRRS病毒后猪的BAL液中的病毒载量。在用野生型 PRRS病毒LTX1激发后第14天从模拟接种、接种IngelvacPRRSMLV或接种G16X病毒的动 物的肺采集BAL液。还在此时间点从未激发且未接种动物（严格对照）（η= 6)获得样品。 通过在ZMAC细胞中进行传染性病毒滴定来测定每只动物的BAL液中的病毒载量。提供各 个猪的结果，然后仅使用病毒阳性样品计算每组成员的平均值（水平柱）。
【具体实施方式】
[0040] 猪繁殖与呼吸综合征病毒在20世纪80年代后期首先出现在美国。过去几年中美 国猪种群中PRRS患病率的显著增加最好地说明了需要新工具来控制PRRS的令人信服的证 据。动植物卫生检验局（APHIS)所进行的血清学调查表明，在2000年观察到的养殖者/加 工者（grower/finisher)美国猪群中PRRS的最初患病率为35%，到2006年增加到53%。 从那时起，所述患病率持续升高，到2009年所述患病率令人担忧地高达71 %，这代表在9年 中患病率>200%的增加。现在，美国70%以上的猪群被北美型（基因型2)PRRS病毒感染， 导致每年的经济损失超过6. 64亿美元，使PRRS成为猪养殖业带来损失最高的疾病。
[0041] 作为猪养殖业的主要经济问题，美国国家猪肉委员会（NPB)将在猪的商业种群中 控制和根除PRRS病毒视为最优先的事。但是，疾病控制被证明难以在很大程度上实现，因 为该病毒的RNA基因组表现出很高的突变速率，这导致显著且持续的遗传/抗原病毒的多 样化。这可通过以下事实得到清楚的说明：存在这样的9种明确定义的2型（或北美样） PRRS病毒谱系，在其之间表现出较大的系统发生差异。从25年前这一主要的猪病原体首 次出现起，所述9种不同的北美样PRRS病毒谱系就已经出现，并且包含了目前世界上存在 的PRRSV病毒的大的遗传差异。这些谱系在遗传上是不同的，这可通过至少11%的谱系内 多样性来证实。大多数（>95%)在美国已分离的PRRS病毒属于这些谱系中的四个，即谱系 1、5、8 和 9。
[0042] 通常认为，PRRSMLV疫苗针对因有毒力的PRRS病毒感染而导致的疾病的保护性 效力水平主要取决于所述两种病毒的遗传相似性（同源性）。因此，基于本领域中表现出的 集体智慧，同时期的PRRS病毒毒株之间的遗传多样性中的时间依赖性的增加，应当会使具 有过时基因型的减毒PRRS病毒疫苗不能在猪中赋予针对最近进化的PRRS病毒的充分有效 的保护性免疫。因此，应当注意到，