肺部的 总体病理学。测量全部所述参数所获得的结果支持以下结论：89-46448-40分离株在猪中 的毒力是可忽略不计的。
[0117] 为了确定89-46448-40病毒分离株所表现出的毒力水平，用89-46448-40分离株 或作为比较用高毒力的"非典型PRRS"病毒分离株NADC-20接种来自未感染PRRS病毒的 猪群的9-10周龄猪的组。对照组由被给予模拟接种物的猪组成。在病毒接种前和接种后 第4、7、10和14天，从每只猪的颈静脉采集静脉血并通过测量每只动物血清中存在的传染 性病毒的量来定量测定病毒血症的程度。在研究的第〇、7和14天记录所有猪的体重，并计 算从激发那天起的体重改变。在接种后第14天使用已知方法对猪肺部的总体病理学程度 进行评分。
[0118] 使用组织培养瓶（Corning,Corning,NY)在含有L-谷氨酰胺 (Mediatec，Herndon,VA)的RPMI-1640培养基中培养猪肺泡巨噬细胞细胞系 ZMAC(Calzada-Novaetal.，2012)并保持在37°C下5%(：02的气氛中，所述培养基补充了 10%胎牛血清（G丨BCCKS),Invitrogen，GrandIsland，NY)、lmM丙酮酸钠（Mediatec)和 IX非必需氨基酸（Mediatec)。因为猪肺泡巨噬细胞是所述病毒的天然宿主细胞，ZMAC细 胞对野生型PRRS病毒是完全受纳的。因此，使用此细胞系来进行对来自临床（血清）样品 的PRRS病毒的滴定，并且制备用于动物接种的病毒原液。所述ZMAC细胞系不含有外来的 病原体，包括牛病毒性腹泻病毒、猪环病毒（circovirus)、支原体、PRRS病毒、猪细小病毒 和猪腺病毒。
[0119] 为了产生用于动物接种的病毒原液，将直接来自于患病动物血清的"急性PRRS"病 毒分离株NADC-20在ZMAC细胞中传代一次。已证明NADC-20在幼猪中产生显著的呼吸疾 病，总体肺损伤评分范围为30-45%，以及导致显著的病毒血症，其程度与针对其他有毒力 的PRRS病毒分尚株所观察到的病毒血症程度相似。89-46448-40病毒的接种物是从ZMAC 细胞中的第7次传代制备，所述传代起始于由NVSL所制备的89-46448-40病毒的初始小瓶 (89-46448-40MA104/2)。获得自NVSL的所述小瓶中的病毒代表来自病例89-46448样品 的89-46448-40病毒在MA-104细胞中的第2次传代。为了进行动物接种，在补充了 0. 05 % 的新生猪血清的磷酸盐缓冲溶液（Mediatech)(稀释剂）中稀释所述病毒以获得104TCID5。/ ml的病毒效价。模拟接种物仅由稀释剂组成。然后通过在ZMAC中进行滴定（TCID5。）来验 证从89-46448-40或NADC-20病毒原液制备的那些接种物中传染性病毒的预期效价。
[0120] 如下测定传染性病毒的效价。在包含0.9ml补充了 5%胎牛血清（Gibco)的 RPMI-1640培养基（Mediatech)的管中，将每个病毒接种物连续稀释10倍至最终稀释率为 10 5-1〇 8,这取决于样品的类型。将每个被检测的稀释样品的0.lml等分试样单独地转移到 96孔组织培养板的四个孔中，每个孔包含0.lml培养基，所述培养基中含有3-4X104ZMAC 细胞。在37°C下湿润的5%C02氛围的环境中96h后，使用倒置显微镜检查每个孔中的细 胞中细胞病变效应的存在。当其中>90%的细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，孔被评分 为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方法来测定每个样品的TCID5。数。对从感染了病毒 或未感染病毒)_的各个猪中采集的每个血清和支气管肺泡灌洗（bal)液样品进行 相似的病毒感染力滴定。
[0121] 使用具有数字读数的天平来测量每只猪的体重。在每次使用前和使用后使用校准 重量来对所述天平进行校准。在研究的第1天（临病毒感染前）和病毒感染后第7和14 天对全部猪进行称重。计算各个猪在接种后第7和14天时相对于病毒暴露当天其各自体 重所达到的体重增加。将结果表示为每个处理组的平均调整体重改变土均值的标准误差 (SEM)〇
[0122] 获得支气管肺泡灌洗（BAL)样品。在病毒激发后第14天对动物实施安乐 死，将其肺从胸腔内完整移出。通过使用20cc塑料注射器将无菌Dulbecco's磷酸 盐缓冲盐水（Mediatech)输注到每个肺的右中肺叶，而从每个肺获得BAL液样品，所 述塑料注射器与去掉了针头的管状输注装置（Butterfly19X7/812"管，Abbott Laboratories,Chicago,IL)连接。将管插入到通向右中肺叶的支气管中并用线将二者绑在 一起以避免渗漏。然后，将l〇mlDulbecco's磷酸盐缓冲溶液缓慢推入所述肺叶。轻轻按 摩被灌洗的肺叶之后，通过缓慢缩回活塞将液体移出。通常可容易地回收一半（5ml)输注 液。然后将BAL液转移至无菌的15ccFalcon聚丙稀维形管（BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)，收集后在4°C下保存不超过4h。然后通过以2000rpm离心10min，使所述BAL 液澄清，将所获得的液体分成lml等分试样，放入无菌的无RNA酶和DNA酶&热原的1. 7ml Posi-Click管（DenvilleScientific)中，并存于_80°C直到用于检测病毒载量。
[0123] 如下进行总体肺损伤评分。接种后14天，对全部动物实施安乐死。将其肺从胸 腔中移出并根据Halbur等人（1995)所描述的评分系统计学估该器官中总体损伤（gross lesion)的程度。简言之，为每个肺叶指定一定量的点以反映该肺叶所代表的整个肺的近 似体积百分数。例如，给右前肺叶、右中肺叶、左前肺叶的前部和左前肺叶的尾部指定10点 (背侧5点，腹侧5点）。副叶被分配5点，右肺和左肺尾叶各分配27. 5点（背侧15点，腹 侧12. 5点）以达到总计100点。根据对每个肺叶中的显微结构肺损伤的存在情况的检查， 评估每个肺叶中肺炎的程度，该百分数乘以每个指定的肺叶点产生一个数值，当该数值与 所确定的所有其他肺叶的数值加在一起时产生一个得分，其表示遭受显著可见的肺炎的整 个肺部的总体百分数。
[0124] 将来自无PRRS农场的混合喂养的猪（YorkshireXLandraceXDuroc)随机分配 到伊利诺伊大学（伊利诺伊州厄巴纳）动物生物控制设施的具有独立空气调节的两个独 立套间（8个隔间/套间）的隔间（3-4只猪/隔间）。用基于玉米的无药物猪II期饮食 (UniversityofIllinoisFeedMill,Champaign,IL)喂养动物。根据生物医学分级措施 圈养所述猪，保持12h光照/黑暗周期并使其任意饮水和进食。在9-10周龄时，用2ml(每 种途径lml，104TCID5(]/ml)两种病毒之一（89-46448-40或NADC-20)或模拟接种物（仅为稀 释剂）经鼻内和肌肉内途径感染动物。通过在每个套间中仅用一种类型的病毒分离株接种 猪，使一个隔间中的全部动物都感染相同类型的病毒分离株，从而避免研究期间猪的交叉 感染。模拟接种的动物被保留在与圈养病毒感染的动物相同的套间但是地理位置不同的隔 间中。遵守严格的生物控制措施以使所述模拟接种猪不会感染PRRS病毒并避免套间之间 的交叉污染。从病毒引入的当天直至之后的14天的时期内，每天监测动物的活力的改变和 呼吸性窘迫的征象。在接种之前及接种后的第4、7、10和14天使用没有添加剂的MONOJECT? 血液采集管（TycoHealthcareGroup,Mansfield,ΜΑ)从颈静脉采集血液样品。通过离心 从凝固血液中分离血清，收获并以在无菌的1. 5ml微量离心管中的小等分试样的形式冷冻 保存在_80°C下直至检测。通过如上所述在ZMAC细胞中测量所制备的血清样品中传染性病 毒的量来测定猪中病毒血症的水平。血清样品的临床观察和分析确认，未发生控制套间之 间PRRS病毒分离株的交叉感染和模拟接种的对照猪感染PRRS病毒。在临病毒感染前和病 毒感染后第7和14天测定每只猪的体重。在病毒暴露后14天对全部动物实施安乐死，将 其肺从胸腔内移出并如上所述对总体病理学进行评分。
[0125] 如所述进行统计学分析。应用一般线性模型单变量措施和Fisher'sLSD检验来 评估组之间关于病毒血症的程度（l〇g1(]TCID5(]/ml)和总体肺部病理学得分（为了分析进行 logi。变换）的差异。使用Dunnett'st检验（双侧）将从病毒暴露时到之后7和14天 猪的体重改变比例与参考（模拟接种）组中测量的相同参数进行比较。使用SAS?软件 (Cary，NC)进行统计学分析。P值〈0. 01被认为是统计学上显著的。
[0126] 结果：PRRS病毒89-46448-40或NADC-20对被感染的猪的体重增加的影响。用 PRRS病毒89-46448-40(η= 6)或NADC-20(η= 10)分离株感染养殖的猪或模拟感染（η =10)养殖的猪，测定在感染后第7和14天时各个动物体重增加的百分数并计算每组成 员的平均值（图1)。在病毒感染后第7天，模拟处理的对照组表现出24. 8±1 %的平均体 重增加，而对于用89-46448-40病毒接种的组这一改变是18. 6±2. 2%。89-46448-40病 毒感染的猪所实现的平均生长为对照组动物所实现的平均生长的3/4,这两组的体重增加 平均值没有统计上的差异（Ρ>〇.09)。相反，在相同的时期中，NADC-20病毒感染的组平均 体重增加仅为6.4±2.4%，其与相应的模拟处理的动物所获得的增加（几乎是其4倍）在 统计学上有显著差异（P〈〇.001)。同样，在病毒接种后的14天间隔后，89-46448-40病毒 感染的猪和模拟感染的猪的平均体重增加为45±2. 5%和52±1. 6%，两者之间没有显著 差异（p>0. 2)，在这种情况下体重增加分别为45±2. 5%和52±1.6%。再一次，NADC-20 病毒接种组的生长与对照动物的生长相比被显著削弱（P〈〇. 001)，因为前者仅实现了 26. 5 ±3. 6 %的平均增加。
[0127] 测定用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20感染的猪中病毒血症和肺部的 病毒载量。当在临接种前取样时，未在任何动物的血清中检测到传染性病毒，确认它们的无 PRRS病毒状态（图2)。同样，对于模拟接种组，在其他动物病毒接种后所取的任何样品中都 未发现活病毒，确认未发生对照组的非故意感染。在接种后4天，用NADC-20或89-46448-40 病毒感染的所有动物都有病毒血症。但是，与表现出组平均值为l〇41±ai2TCIDM/ml的 NADC-20组相比，用89-46448-40感染的猪组表现出显著更低（p〈0. 001)的病毒血症水 平，其组平均值为l(f9±ai9TCIDM/ml。在感染后第7天两组的病毒血症水平都达到峰值， NADC-20病毒感染的猪的血清表现出的平均病毒血症水平为104·6±a27TCIDM/ml，其比在 89-46448-40病毒感染的动物的血清中检测到的l(f°±ai4TCID5Q/ml高>30倍（p〈0. 001)。到 了感染后第10天，两组的病毒血症水平都开始下降，但是用89-46448-40分离株感染的猪 中速率更快，这可由以下事实说明：89-46448-40病毒接种的组的血清中的平均病毒浓度 (l(f°±a4T(nD5Q/ml)与NADC-20分离株接种的组中检测到的平均病毒浓度（l(f9±ai4TCID5。/ ml)相比低>70倍（p〈0. 001)。4天后，这两组中检测到的平均病毒血症水平仍保持显著差异 (p〈0. 005)。但是，此时89-46448-40病毒感染的动物中仅有50%有病毒血症，而用NADC-20 病毒接种的动物中90%仍然有病毒血症。在实施安乐死时（病毒暴露后14天），暴露于 NADC-20病毒的猪中90%的肺中发现了传染性病毒，得到的组几何平均值为l(f3TCID5。/ ml。相比之下，对于用89-46448-40病毒接种的组，这个值仅为10L1TCID5Q/ml，仅一半成员 在其肺中具有可检测的传染性病毒。
[0128] 在用PRRS病毒89-46448-40或NADC-20病毒接种后第14天，为了对肺炎程度 进行定量，对研究中所有动物的肺部总体损伤进行评分。就个体而言，评估的模拟接种或 89-46448-40病毒接种组的所有猪，其总体肺部损伤得分都〈25%。相比之下，NADC-20病 毒感染组的10个成员中的6个被评估为具有多25 %的总体肺部损伤得分，包括两只猪的得 分为>75%。如预期的那样，模拟接种对照组的动物大多数具有正常的肺，个体得分范围为 0至15%，取平均值至平均组得分为3. 5±2% (图3)。当计算89-46448-40病毒接种组的 猪时，平均值升高至12. 3±3. 3%。就个体而言，其肺部得分从低至0.7%到高至24%。当 评估NADC-20病毒接种的猪的肺部时，这些个体得分要高得多。在此，个体总体肺部损伤得 分范围从7至78%，导致组平均得分为36. 5±7. 7%。由于每个处理组内部的个体猪的得 分差异>10倍，因此将该数据转化为l〇gl。数值用于进行统计学分析。之后，确定模拟处理 组和89-48448-40病毒接种组的平均总体肺部损伤得分之间没有统计学上的差异。但是， 当在模拟处理组和NADC-20病毒接种组之间进行该比较时，观察到显著的差异（p〈0. 001)。
[0129] 本实施例中的数据说明，89-46448-40PRRS病毒分离株天然表现出可忽略不计的 毒力水平。例如，用89-46448-40分离株接种的猪保持与模拟处理组的猪相等的生长速度。 此外，由用89-46448-40病毒分离株接种猪所引起的病毒血症的程度显著低于接受有毒力 的PRRS病毒分离株NADC-20的同龄组（cohort)中所观察到的病毒血症的程度。此外，用 89-46448-40病毒分尚株感染幼猪后，病毒血症的时间长短和肺中病毒的存在时间比所报 道的用PRRS病毒的其他野生型或减毒毒株感染同龄动物后的持续时间更短。最后，当考虑 模拟感染组和89-46448-40病毒接种组时，由平均总体肺部损伤得分所指示的肺炎程度没 有统计学上的差异。总之，PRRS病毒分离株89-46448-40所天然表现出的可忽略的毒力水 平类似于（如果不低于）使用通过体外连续传代产生的PRRS病毒减毒毒株时所观察到的 毒力水平。
[0130] 实施例3
[0131] 亲代89-46448-40病毒与G16X、794A61和111698PRRS病毒毒株之间的基因组和 生物学差异
[0132] 实施例3.本实施例说明PRRS病毒分离株89-46448-40的原始原液包括遗传上相 关的病毒的离散混合物。使用标准噬菌斑测定（794A61和G16X)或终点稀释（111698)从 89-46448-40病毒原液获得三种PRRS病毒毒株并将其纯化至具有同质。纯化的794A61、 111698和G16X病毒毒株的基因组与存在于初始的89-46448-40病毒原液中的病毒种群的 差异在于，若干非同义和同义核苷酸点突变。后者导致分别在794A6UG16X和111698病毒 毒株的结构和非结构病毒蛋白中分布的2、3或5个氨基酸改变，不认为89-46448-40亲代 病毒原液的翻译基因组中具有所述氨基酸改变。使所述三种衍生毒株与亲代89-46448-40 原液中的病毒区分开的具有预测的氨基酸序列改变的病毒蛋白包括非结构蛋白（Nsp)2、结 构蛋白E和糖蛋白（GP)3和GP4。参见图4A-4D。所述794A6UG16X和111698病毒毒株与 亲代89-46448-40病毒分离株还具有生物学上的差异，如其刺激猪肺泡巨噬细胞的相当高 的干扰素α应答的能力所证明的。此外，不同于89-46448-40病毒分离株，G16X毒株不抑 制猪肺泡巨噬细胞产生干扰素α，而是响应于多聚（I:C)对猪肺泡巨噬细胞的刺激而增强 干扰素α合成。
[0133] 表1PRRS病毒毒株794Α61、111698和G16X之中与祖先病毒89-46448-40相关的 氨基酸。
[0134]
[0135] 如表1所示，所述病毒在包括NSP2、E、GP3和/或GP4在内的蛋白中具有一个或 多个突变，所述突变包括以下中的一个或多个：对于NSP2,495Leu、338His;对于E，31Val、 60Ala;对于GP3,94Val、213Phe;对于GP4,32Ser。
[0136] 在包含完全MEM的75cm2组织培养瓶中制备猿猴细胞系MARC-145的单层，所述完 全MEM由pH被调至7. 2,并补充有5%胎牛血清、0. 15%碳酸氢钠和抗生素的Eagle's最低 必需培养基（MEM)组成。在37°C下在5%C02的气氛中孵育包含MARC-145细胞和10ml培 养基的培养瓶。使用超低粘附的75cm2组织培养瓶（Corning)在RPMI-1640培养基中培养 猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC(ATCC编号PTA-8764)并保持在37°C下和5% 0)2的气氛中，所 述1?^1-1640培养基含有1^谷氨酰胺（16虹&丨6(3，他《1(1〇11，￥4，1^4)并补充了10%胎牛血 清（G丨BCO?，Invitrogen，GrandIsland，NY，USA)、lmM丙酮酸钠（Mediate。）和IX非 必需氨基酸（Mediatec)。所述ZMAC细胞系不含有外来的病原体，包括牛病毒性腹泻病毒、 猪环病毒、支原体、PRRS病毒、猪细小病毒和猪腺病毒。
[0137] 本研究中所使用的全部PRRS病毒分离株在MARC-145细胞单层中增殖，如Kim等 人（1993)所描述。为了这一目的，用lml病毒悬液接种MARC-145细胞de汇合的单层并 在37°C下孵育lh以使病毒吸附。然后移除所述病毒接种物并添加10ml新鲜的完全MEM。 然后在37°C下在5%C02的气氛中孵育细胞培养物，直到观察到细胞病变效应（4天）。一 旦单层中>75 %的细胞表现出细胞病变效应，收集培养瓶的内含物并纯化或将其分成若 干l-2ml等分试样，装于无菌玻璃或塑料小瓶中并贮存于-80°C直到需要时。用于生物测 定的病毒的纯化从以下步骤开始：首先通过在4°C下以2000rpm离心lOmin使细胞培养 基澄清。然后将上清液覆盖在SW28转子管（Beckman，PaloAlto,CA)中包含15%蔗糖的 3mlTE缓冲液（10mMTris，pH8.0，lmMEDTA)的上方。然后在 4°C下以 20000rpm离心 3h。然后将包含病毒的片状沉淀重新悬浮于lmlTE缓冲液中，通过0.2μΜ注射器式滤器 (Nalgene,Rochester,ΝΥ)并以等分试样存于_80°C直到需要时。
[0138] 本研究中使用的病毒的来源已在上文中描述。其基因组被用于核苷酸测序分析 的病毒是：由NVSL提供给伊利诺伊大学VDL的原始89-46448-40分离株（89-46448-40 MA104/2) ;"794原液"的6倍噬菌斑纯化的初次传代，所述"794原液"是在伊利诺伊大学进 行的 89-46448-40MA104/2 在MARC-145 细胞中的第二次传代（794A61P1) ;"794 原液"在 MARC-145细胞中的终点稀释（Μ0Ι= 0. 001)传代；以及获得自病毒的两轮噬菌斑纯化的噬 菌斑的第二次传代，所述病毒是从"794原液"在MARC-145细胞中在高M0I(M0I= 1. 0)下的 初次随后传代中获得（G16XP2)。用于评估PRRS病毒对猪肺泡巨噬细胞产生干扰素α的影 响的病毒制品是：i)89-46448-40ΜΑ104/2在MARC-145细胞中的第三次传代（89-46448-40 P3) ;ii)794A61最终噬菌斑在MARC-145细胞中的第三次传代（794A61P3) ;iii) 111698病 毒在MARC-145细胞中的第三次传代（111698P3) ;iv)G16X最终噬菌斑在MARC-145细胞中 的第五次传代（G16XP5) ;v)野生型NADC-20病毒制品的第二次传代，即是直接从被感染的 猪的血清初次传代到ZMAC细胞中并在MARC-145细胞中传代一次（NADC-20P2);以及vi) FL-12病毒的第三次传代，即由该病毒的传染性克隆转染ZMAC细胞而获得病毒品开始，然 后在MARC-145细胞中传代两次（FL-12P3)。
[0139] 如下进行传染性病毒效价的测定。在包含0. 9ml完全MEM的管中将病毒制品连续 稀释10倍。将每个被检测的稀释样品的0.lml等分试样单独地转移到96孔组织培养板的 四个孔中，所述孔包含覆盖在几乎汇合的MARC-145细胞单层上的0.lml培养基。在37°C下 和湿润的5% 0)2气氛环境中培养5天后，使用倒置显微镜检查每个孔中细胞的细胞病变效 应的存在。当其中>90%的细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，将孔评分为病毒感染阳 性。使用Reed和Muench方法来测定每个样品的TCID5。数。
[0140] 为了分离PRRS病毒基因组RNA，使用QI